C. elegans mediciones del área muscular: Un método estandarizado para cuantificar la morfología muscular estriada

Overview

C. elegans tienen dos tipos de músculos, sarcomere único y sarcomere múltiple, o músculos estriados.  Este video describe la disposición de los músculos de la pared del cuerpo estriados, que son responsablesdela locomoción de un gusano e incluye un protocolo de muestra para medir la morfología muscular utilizando software de análisis de imágenes.

Protocol

Este protocolo se extrae de Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures y Organelle Morphology en Caenorhabditis elegans, J. Vis. (2019).

1. Cuantificación de la estructura muscular de la pared corporal

1. Imágenes de fluorescenciade la estructura muscular de la pared corporal 
   1. Obtener una cepa (por ejemplo, RW1596) que lleve el transgénero stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), que etiqueta las fibras de miosina con GFP.
      NOTA: La introducción del transgénero en animales puede lograrse cruzando una cepa de interés con animales que ya expresan el transgénero, o microinyecto de ADN en el brazo distal de la gónada. El fenotipo 'rolling' inducido por la mutación rol-6 en este transgénero facilita la visualización de los músculos. Los músculos de la pared del cuerpo corren a lo largo de los lados dorsales y ventrales que normalmente se les impide ver en animales de tipo salvaje porque por lo general se encuentran en uno de sus lados laterales. El alelo rol-6(su1006) induce la torsión de los animales, exponiendo así algunas células musculares para la toma de imágenes.
   2. Imagine a los animales utilizando un microscopio de fluorescencia junto con una cámara de dispositivo acoplada cargada de alta resolución (CCD), 40X objetivo o superior, filtro GFP y software de adquisición.
   3. Ajuste el tiempo de exposición y la intensidad de la iluminación para evitar imágenes sobresaturadas.
   4. Capturar y guardar imágenes de los músculos (aumento de 400X) de una sección del animal que contiene al menos una célula muscular oblicua visible completa. Evite las regiones con una sola célula muscular que esté incompleta o secciones que estén fuera de foco. También excluir imágenes de regiones anteriores y posteriores extremas, y regiones adyacentes a la vulva.
      NOTA: Si el animal no tiene una sola célula muscular completa visible, deslice suavemente la cubierta para girar al animal con el fin de exponer una célula completa.
2. Medición del área de células musculares
   1. Abra la imagen en el software de Fiji (la versión 2.0.0 se utilizó en este estudio).
   2. Utilice la selección del polígono para rastrear cuidadosamente alrededor de una sola célula muscular oblicua. Ajuste la línea del polígono al final arrastrando el punto de anclaje para mejorar el trazado.
   3. Vaya a la pestaña Analizar en la parte superior del software y haga clic en Medir para calcular el área de la selección. Se mostrará una tabla de resultados independiente que contiene el área y otras mediciones. Si falta la medición de área de la tabla de resultados, vaya a Establecer mediciones en la pestaña Analizar y compruebe que la casilla de área está marcada. Del mismo modo, desenváse otras mediciones que no sean necesarias.
   4. Para las células musculares con una región degenerada/faltante, trace la región que falta con la herramienta de selección de polígonos y haga clic en Medir de nuevo. Si hay varios huecos dentro de la celda, trace cada espacio por separado.
   5. Calcule la relación del área de separación con toda la célula muscular única. Una alta proporción indica una mayor extensión de degeneración muscular debido a grandes brechas dentro de la célula. Si no faltan regiones, como se ve comúnmente en animales de tipo salvaje, la proporción se calcularía como cero.
      NOTA: Como control, puntuación también para defectos de estructura muscular visualmente y comparar resultados con la medición cuantitativa. Esto es especialmente útil si la cepa se está estudiando por primera vez en el laboratorio. Para la puntuación fenotípica, evalúe a los animales como defectuosos o no defectuosos en función de la integridad de los filamentos. Por ejemplo, los animales con pérdida de estrías de filamentos distintas, aglomeración de GFP, o huecos dentro de las células musculares debido a la descomposición estructural, serían puntuados como defectuosos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40