Эпидермальный лазерный раны: индуцирование локализованных повреждений для изучения процессов ремонта в C. elegans

Overview

Это видео вводит метод лазерного раны, который используется, чтобы вызвать очень точные травмы в эпидермис червя.  Протокол выборки взяты из исследования реакции раны и ремонта.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Сюй и Chisholm, Методы для раны кожи и анализы для ран ответов в C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Лазерное ранение

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фемтосекундное лазерное облучение (800 нм) для выполнения более точного ранения.

1. Приготовьте агарные прокладки на стеклянной горке с расплавленным 2% агара. Убедитесь, что прокладки похожи на агар колодки, используемые для живой визуализации C. elegans.
2. Перенесите 10 молодых взрослых червей на агарозную площадку с помощью червя и добавьте 2 мл капли 12 мМ Левамизол раствора. Обложка животных и жидкости с крышкой скольжения. Подождите 1-2 мин для червей, чтобы парализовать.
3. Поместите стеклянную горку на вращающийся дисковый конфокальный микроскоп. Перемещение этапе, чтобы найти червей и сосредоточиться на боковой передней или задней синцитиальной эпидермис с 100X цели (NA 1.4-1.46).
4. Установите мощность фемтосекундного лазера до 140 мВт (измеряется перед целью). Используйте фемтосекундный лазер со скоростью повторения 80 МГц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ранения в наших руках достаточно двух импульсов по 200 мсек каждый (разделенный на 20 мсек).
5. Сосредоточьтесь на апической поверхности эпидермальной клетки и рана эпидермиса. Наблюдайте локальное нарушение цитоплазмы (пузырьков) или локальное отбеливание любого используемого флуоресцентного маркера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте соответствующим процедурам лазерной безопасности при использовании фемтосекундного лазера. Сканирование линии или точки с помощью фемтосекундных лазеров, таких как два фотон-микроскопа, должно обеспечить достаточную мощность для лазерного раны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя у нас нет прямого опыта использования других лазеров, в принципе раны должны быть возможны с помощью обычных УФ-лазеров (как это используется в C. elegans клеточных абляций). Дополнительно используйте модуль Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) на вращающемся конфокальце диска, чтобы ранить эпидермис (N. Pujol, личное общение).