새로운 탱크 다이빙 분석: 제브라피시의 선천적 스트레스 반응을 연구하는 방법

Abstract

출처: Chin J.S.R., et al. 제브라피쉬의 선천적 스트레스를 연구하기 위한 행동적 접근. J. Vis. 특급 (2019년)

이 기사는 제브라피시의 스트레스를 평가하는 행동 방법을 설명합니다. 스트레스에 대한 반응으로 제브라피쉬는 스트레스가 제거될 때까지 수조 바닥에서 수영하는 경향이 있습니다. 샘플 프로토콜은 분석을 수행하기 위한 단계적 방법을 설명합니다.

Protocol

1. 새로운 탱크 테스트 설정

1. 물고기 시스템 물로 미리 채워진 250mL 비커와 최소 두 개의 저장 탱크를 준비합니다.
2. 실험 당일 아침, 각 실험 조건(대조군 및 실험 성체)에 사용할 최소 10마리의 실험용 성체 제브라피시를 어류 시설에서 저장 탱크로 옮기고 행동실로 옮겨 최소 1시간 동안 적응할 수 있도록 합니다.
   메모: 검정력 분석은 실험 전에 수행되어야 하지만, 우리 손에서는 일반적으로 n = 10이 통계적 유의성을 감지하기에 충분합니다. 또한 저장 탱크에는 물 1리터당 5명 이하의 개체가 포함되어야 합니다. 제브라피시 성충은 새 수조에서 30분 이내에 적응하는 것으로 나타났으므로 1시간의 적응으로 충분합니다. 또한 행동 리듬은 일주기 과정의 영향을 받기 때문에 다른 날에 수행된 실험적 반복은 동일한 시간 내에 수행되어야 합니다. 일반적으로 오전 11:00에서 오후 6:00 사이에 모든 실험을 수행합니다.
3. 동물의 상태나 유전자형이 실험자에게 보이지 않도록 탱크에 레이블을 지정합니다.
   메모: 실험은 문자 또는 숫자 체계를 사용하여 탱크에 라벨을 붙임으로써 실험자에게 쉽게 눈을 멀게 할 수 있습니다(즉, 한 탱크는 'A', 다른 탱크는 'B'로 표시됨). 실험에 참여하지 않은 당사자는 이러한 시스템으로 탱크에 레이블을 지정하고 사후 분석이 완료될 때까지 실험자의 신원을 마스킹합니다.
4. 그물을 사용하여 1.1단계에서 미리 채워진 비커에 성인 한 명을 부드럽게 놓습니다. 다 자란 물고기가 10분 동안 비커에 적응하도록 합니다.
   메모: 성별에 따른 차이를 찾는 것이 사후 분석이 중요할 수 있으므로 성인의 성별을 기록합니다.
5. 비커에 적응한 후 비커에서 물과 성인을 부드럽게 쏟아 부어 물고기를 새로운 수조에 소개합니다(아래 세부 정보 설정).
   메모: 이 섹션의 단계에서는 새로운 탱크 분석 설정에 대해 설명합니다. 최종 제품의 다이어그램은 그림 1B에 나와 있습니다.
   1. 테이블 중앙에 소설 탱크를 놓습니다.
   2. 탱크 뒤에 적외선을 배치하고 탱크와 LED 광원 사이에 흰색 아크릴 시트 또는 디퓨저 스크린을 놓습니다.
   3. LED에서 나오는 빛을 최대한 확산시키고 빛의 강도가 새로운 탱크를 비추기에 충분하도록 디퓨저를 배치하십시오. 보드가 광원에 가까울수록 조명이 더 밝아지지만 확산은 줄어듭니다. 대조적으로, 디퓨저 보드를 광원에서 멀리 배치하면 광도가 감소하지만 빛이 더 잘 퍼집니다.
   4. 새로운 수조의 약 4분의 3을 물고기 시스템 물로 채웁니다.
      메모: 시스템 물은 수돗물의 역삼투를 사용하여 생성된 다음 전도도가 900 ± 100 μS이고 pH가 중성(7.2)이며 온도가 27 ± 1 °C가 되도록 주입합니다.
   5. 카메라를 카메라 스탠드에 부착하고 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 비디오 획득 소프트웨어를 열고 탱크 전면을 향하도록 카메라를 조정하고 새로운 탱크 전체를 볼 수 있고 비디오에 가려진 영역이 없는지 확인합니다. 카메라를 통해 관찰할 때 탱크 전체에 충분하고 균일한 조명이 있도록 탱크와 적외선을 조정하십시오.
      메모: 실험을 진행하기 전에 물고기의 비디오를 캡처하고 추적을 수행하는 시험 실행을 수행하는 것이 종종 유용할 수 있습니다. 이렇게 하면 설정이 동작 실험에 충분한지 확인할 수 있습니다.
6. 성인을 새로운 수조에 도입한 후 카메라 녹화를 시작하고 물고기가 추가로 고통을 겪는 것을 방지하기 위해 설정에서 멀리 떨어집니다.
7. 녹음이 끝나면 새로운 탱크에서 개인을 제거하고 새 저장 탱크에 넣습니다.
   메모: 1.2단계와 다른 저장 탱크를 사용하여 동일한 개인에 대한 반복 테스트를 방지해야 합니다.

Results

그림 1. 새로운 탱크 설정 다이어그램.(A) 탱크의 기록 측면에서 본 1.8L 사다리꼴 소설 탱크의 치수. (B) 인간의 간섭을 최소화하는 데 사용되는 적외선, 카메라 및 장벽의 위치를 포함한 설정 다이어그램.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
사진기			우리는 Edmund Optics의 렌즈가 장착된 Point Grey Grasshopper3 USB 카메라를 사용합니다.
적외선 필터	에드몬드 옵틱
비디오 획득 프로그램			획득 프레임 속도를 설정할 수 있으므로 Virtualdub 또는 FlyCapture와 같은 프로그램을 사용하십시오.
적외선 LED 조명
분석 탱크	아쿠아니어링	부품 번호 ZT180	크기 : M3 1.8 리터
스탠드 및 클램프 또는 카메라용 표준 삼각대
250mL 비커
추적 소프트웨어			우리는 Noldus Information Technology의 Ethovision XT 13을 사용합니다

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