새로운 탱크 다이빙 분석 : 제브라피시의 타고난 스트레스 반응을 연구하는 방법

Overview

이 기사는 제브라피시의 스트레스를 평가하는 행동 방법을 설명합니다. 스트레스에 대한 응답으로, 제브라피쉬는 스트레스를 제거할 때까지 탱크 바닥에서 수영하는 경향이 있습니다. 샘플 프로토콜은 분석법을 수행하기 위한 단계별 방법을 설명합니다.

Protocol

1. 소설 탱크 테스트 설정

1. 물고기 시스템 물로 미리 채워진 250mL 비커와 적어도 두 개의 홀딩 탱크를 준비하십시오.
2. 시험의 아침에, 적어도 10 테스트 성인 제브라피쉬를 수산 시설에서 지주 탱크로 각 실험 조건(대조군 및 실험성인)에 사용하고, 행동실로 옮기고, 적어도 1시간 동안 적응할 수 있도록 한다.
   참고: 전력 분석은 실험 전에 수행해야하지만, 우리의 손에, n = 10은 일반적으로 통계적 유의를 감지하기에 충분하다. 또한, 홀딩 탱크는 물 리터 당 5 명 이하의 개인을 포함해서는 안됩니다. 제브라피쉬 성인이 새로운 탱크에서 30분 이내에 습관화하는 것으로 나타났기 때문에 1시간의 적응만으로도 충분합니다. 또한 행동 리듬은 circadian 프로세스에 의해 영향을 받아 다른 날에 수행된 실험 복제는 같은 시간 내에 수행되어야 합니다. 우리는 일반적으로 11:00 am과 6:00 pm 사이의 모든 실험을 수행합니다.
3. 동물의 상태 또는 유전자형이 실험자에게 눈이 멀도록 탱크에 라벨을 붙입니다.
   참고: 실험은 문자 또는 번호 시스템을 사용하여 탱크에 라벨을 붙임으로써 실험자를 쉽게 눈멀게 할 수 있습니다 (즉, 한 탱크는 'A', 다른 'B'등)라고 표시됩니다. 실험에 관여하지 않은 당사자는 이러한 시스템으로 탱크에 레이블을 지정하고, 사후 분석이 완료될 때까지 실험자의 ID를 마스크합니다.
4. 그물을 사용하여 1.1 단계에서 미리 채워진 비커에 성인 한 개를 부드럽게 놓습니다. 성인 생선이 비커에 10분 동안 적응할 수 있도록 허용합니다.
   참고: 성인의 성별을 기록, 그것은 섹스 특정 차이 찾기 위해 중요한 사후 분석 될 수 있습니다.
5. 비커에 적응 한 후, 부드럽게 비커에서 물과 성인을 부어 새로운 탱크 (아래 세부 사항을 설정)에 물고기를 소개합니다.
   참고: 이 섹션의 단계는 새로운 탱크 분석설정을 설명합니다. 최종 제품의 다이어그램은 도 1B에부여됩니다.
   1. 참신한 탱크를 테이블 중앙에 놓습니다.
   2. 적외선 조명을 탱크 뒤에 배치하고 흰색 아크릴 시트 또는 디퓨저 스크린을 탱크와 LED 광원 사이에 배치합니다.
   3. 디퓨저를 배치하여 LED에서 나오는 빛을 최대한 확산시키고 빛의 강도가 참신한 탱크를 비추기에 충분합니다. 보드가 광원에 가까울수록 조명이 밝아지지만 확산될 수록 분산이 줄어듭니다. 대조적으로, 디퓨저 보드를 광원에서 멀리 두면 광강도를 감소시키지만 빛을 더 잘 퍼뜨릴 수 있습니다.
   4. 참신한 탱크의 약 3분의 1을 어류 시스템 물로 채웁니다.
      참고: 시스템 물은 수돗물의 역삼투를 사용하여 생성되며, 그 다음으로 전도도가 900 μS±, pH가 중성(7.2)이고 온도가 27 ± 1°C이다.
   5. 카메라를 카메라 스탠드에 부착하고 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 비디오 수집 소프트웨어를 열고 카메라를 조정하여 탱크 의 전면을 향하고 전체 새로운 탱크를 볼 수 있으며 비디오에 가려진 영역이 없도록합니다. 탱크와 적외선을 조정하여 카메라를 통해 관찰할 때 탱크 전체에 충분한 조명이 있고 균일하게 조명됩니다.
      참고: 실험을 진행하기 전에 물고기의 비디오가 캡처되고 추적이 수행되는 시험 실행을 수행하는 것이 유용할 수 있습니다. 이렇게 하면 설정이 동작 실험에 충분합니다.
6. 새로운 탱크에 성인을 소개 한 후, 카메라 녹화를 시작하고 물고기에 추가 고통을 방지하기 위해 설정에서 멀리 이동합니다.
7. 녹음이 끝나면, 새로운 탱크에서 개인을 제거하고 새로운 홀딩 탱크에 배치합니다.
   참고: 1.2 단계의 것과다른 홀딩 탱크를 사용하여 동일한 개인에 대한 반복 테스트를 방지해야합니다.

Representative Results

그림 1. 새로운 탱크 설정의 다이어그램. (A)탱크의 레코딩 측에서 볼 수 있듯이 1.8 L 사다리꼴 참작 탱크의 치수. (B)인간의 간섭을 최소화하는 데 사용되는 적외선, 카메라 및 장벽의 위치를 포함하는 설정의 다이어그램.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology