רומן טנק צלילה Assay: שיטה ללמוד תגובות מתח מולד זברה

Overview

המאמר מתאר שיטה התנהגותית להערכת מתח אצל דגי זברה. בתגובה ללחץ, זברה-פיש נוטה לשחות בתחתית המיכל עד להסרת הלחץ. הפרוטוקול לדוגמה מתאר שיטה חורגת לביצוע ההסכמה.

Protocol

1. הגדרת בדיקת טנקים חדשנית

1. הכינו כיף 250 מ"ל מלא מראש במים מערכת דגים, ולפחות שני מיכלים מחזיקים.
2. בבוקר הבדיקה, מעבירים לפחות 10 דגי זברה בוגרים לבדיקה שישמשו לכל מצב ניסיוני (בקרות ומבוגרים ניסיוניים) ממתקן דגים למיכל מעצר, מעבירים אותם לחדר ההתנהגות ומאפשרים להם להתאקלם למשך שעה אחת לפחות.
   שים לב: ניתוח כוח צריך להתבצע לפני הניסוי, עדיין בידיים שלנו, n = 10 הוא בדרך כלל מספיק כדי לזהות מובהקות סטטיסטית. יתר על כן, מיכל ההחזקה צריך להכיל לא יותר מחמישה אנשים לליטר מים. התאקלמות של שעה אחת מספיקה מכיוון שמבוגרים של דגי זברה הוכחו כמגורים בתוך 30 דקות ממיכל חדש. כמו כן, מקצבים התנהגותיים מושפעים מתהליכים צירקדיים, ולכן שכפולים ניסיוניים שנעשו בימים שונים צריכים להתבצע בתוך אותן שעות. בדרך כלל אנו מבצעים את כל הניסויים בין השעות 11:00 עד 18:00.
3. תייג את הטנקים כך שהמצב או הגנוטיפ של בעלי החיים עיוורים לניסוי.
   שים לב: ניסויים יכולים בקלות להיות עיוורים לניסוי על ידי תיוג טנקים באמצעות אות או מערכת מספרים (כלומר, טנק אחד מסומן 'A', אחר 'B', וכו '). גורם שאינו מעורב בניסויים מתייג את הטנקים במערכת כזו, ומסווה את הזהויות מהנסיון עד לאחר סיום הניתוח.
4. באמצעות רשת, הנח בעדינות מבוגר יחיד בזכוכית המלאה מראש משלב 1.1. אפשרו לדגים הבוגרים להתאקלם בקסלר למשך 10 דקות.
   שים לב: להקליט את המין של המבוגר, כפי שזה יכול להיות חשוב לאחר הניתוח לחפש הבדלים ספציפיים למין.
5. לאחר התאקלמות בכומתה, הכניסו את הדגים למיכל הרומן (קבעו פרטים להלן) על ידי שפיכה עדינה של המים והמבוגרים מהכומתה.
   שים לב: השלבים בסעיף זה מתארים את הגדרת מבחני הטנקים החדשניים. דיאגרמה של המוצר הסופי ניתנת באיור 1B.
   1. הנח את מיכל הרומן באמצע השולחן.
   2. מקם את נוריות האינפרא-אדום מאחורי המיכל והנח את גיליון האקריליק הלבן או מסך המפזר בין הטנק למקור נורית ה- LED.
   3. מניחים את המפזר כך שהוא מפזר באופן מקסימלי את האור המגיע מנוריות ה-LED, ועוצמת האור מספיקה כדי להאיר את הטנק החדשני. ככל שהלוח קרוב יותר למקור האור, כך האורות יהיו בהירים יותר, אך ככל שהוא יתפזר פחות. לעומת זאת, הצבת לוח הדיפוזיה הרחק ממקור האור תפחית את עוצמת האור, אך תפיץ את האור טוב יותר.
   4. ממלאים כשלושה רבעים מהמיכל החדש במים של מערכת הדגים.
      שים לב: מי מערכת נוצרים באמצעות אוסמוזה הפוכה של מי ברז, ואחריו מינון כזה מוליכות שווה 900 ± 100 μS, כי pH הוא ניטרלי (7.2), וכי הטמפרטורה היא 27 ± 1 °C (60 °F).
   5. חבר את המצלמה לעמוד המצלמה וחבר את המצלמה למחשב. פתח את תוכנת רכישת הווידאו ולהתאים את המצלמה מול החלק הקדמי של הטנק ולהבטיח את הטנק הרומן כולו ניתן לראות וכי אין אזורים מוסתרים בסרטון. כוונן את המיכל ואת אורות האינפרא אדום כך שיש מספיק ואפילו תאורה בכל המיכל כאשר נצפה דרך המצלמה.
      שים לב: לפני שתמשיך בניסויים, זה יכול להיות שימושי לעתים קרובות לבצע ריצת ניסיון, שבו וידאו של דג נתפס ומעקב מבוצע. פעולה זו תבטיח שההגדרה מספיקה להתנסות בהתנהגות.
6. לאחר החדרת המבוגר למיכל הרומן, התחל בהקלטת המצלמה והתרחק מהמערך כדי למנוע מצוקה נוספת לדגים.
7. לאחר סיום ההקלטה, מוציאים את הפרט מהמיכל החדש ומניחים אותו במיכל מעצר חדש.
   שים לב: יש להשתמש במיכל החזקה שונה מזה שבשלב 1.2 כדי למנוע בדיקות חוזרות ונשנות על אותם אנשים.

Representative Results

איור 1. דיאגרמה של הגדרת הטנק החדש. (A)מידות של מיכל הרומן הטרפז 1.8 L כפי שניתן לראות מצד ההקלטה של הטנק. (ב)דיאגרמה של ההתקנה כוללת מיקומים של אורות אינפרא-אדום, מצלמה ומחסומים המשמשים למזעור ההפרעה האנושית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology