Montage d’agar : une méthode de base pour monter des embryons vivants de poisson zèbre pour l’imagerie à long terme

Overview

Cette vidéo décrit les instructions étape par étape sur le montage d’embryons vivants de poisson zèbre sur 6 plaques de puits à l’aide d’agarose à faible fonte. Il fournit également le processus d’acquisition d’images d’embryons vivants et de l’analyser à l’aide d’un logiciel.

Protocol

1. Configuration du microscope, acquisition d’images, traitement et analyse

1. Préparer un point de fusion faible (LMP) de 0,8 % : Ajouter 0,8 g d’agarose LMP à 100 ml d’E3 et chauffer jusqu’à dissolution complète. Bien que chaud, aliquot 1 ml de LMP agarose dans 1,5 ml de tubes de microfuge dans un bloc de chauffage de 37 °C. L’agarose LMP restera fondu à 37 °C. Ajouter 40 μl de 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaine à chaque aliquot de 1 ml d’agarose LMP à 37 °C. NOTE : Si vous travaillez avec une souche pigmentée, ajoutez 20 μl de 0,15 % (50 x) PTU à chaque aliquot de 1 ml.
   1. Conserver le reste de l’agarose LMP pendant plusieurs mois dans des tubes scellés de 50 ml à 4 °C.
2. Anesthésier les embryons parabiotic à visualiser en ajoutant 1 ml de 4 mg/ml (25x), pH 7,0 tricaine aux 25 ml d’E3 que les embryons sont déjà en.
3. Faites tourbillonner doucement le plat pour que les embryons se billent au milieu. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique à bout large, dessinez les embryons dans le moins de liquide possible. Tournez la pipette droite et faites rebondir doucement les embryons afin qu’ils s’installent au fond de la pipette.
   1. Avec les embryons au fond de la pipette, les transférer à un aliquot de 1 ml de LMP agarose en touchant légèrement la pointe pipette à la surface de l’agarose. Évitez de transférer l’excès de liquide car cela diluera l’agarose.
4. Après avoir expulsé l’excès de liquide de la pipette, utilisez la pipette pour mélanger délicatement les embryons à l’intérieur de l’agarose, puis utilisez la pipette pour transférer tout l’agarose et les embryons au puits d’un fond de verre (no 1,5 coverslip), plaque de 6 puits.
   REMARQUE: Assurez-vous de jeter la pipette après le transfert des embryons dans la plaque d’imagerie. L’agarose résiduelle se mettra à l’intérieur de la pipette, la rendant inefficace pour une utilisation plus supplémentaire. Utilisez plutôt une nouvelle pipette à chaque fois.
5. Sous un stéréoscope, utilisez une pointe de pipette à chargement de gel fixée à l’extrémité d’une aiguille à taquineries manipulée au bois pour positionner les embryons vers le verre de couverture (pour s’assurer qu’ils sont dans la distance de travail de l’objectif du microscope) et dans l’orientation souhaitée pour l’imagerie.
   REMARQUE: Repositionner continuellement jusqu’à ce que l’agarose ait complètement défini. Prenez soin de monter les embryons parabiotic selon lequel l’embryon de la paire doit être photographié. Compte tenu de l’orientation aléatoire des embryons unis, pour certaines paires, il peut être difficile d’imager les deux embryons. Dans ce scénario, récupérer les embryons de l’agarose à l’aide de forceps et d’une pipette de transfert en plastique à bout large, puis remonter pour l’imagerie d’un point de vue différent.
6. Une fois l’agarose réglée, couvrir de 2 à 3 ml d’E3 complété par de la tricaine (et de la PTU si nécessaire).
7. Imagez les embryons à l’aide d’une épi fluorescence inversée à champ large, d’un microscope confocal à balayage laser ou d’un microscope confocal à disque filature. Sélectionnez l’objectif le plus approprié pour l’imagerie désirée. Pour un champ de vision embryonnaire entier, utilisez un objectif 4x. Sélectionnez un grossissement plus élevé, tel qu’un objectif 20x, pour imager un tissu spécifique
   REMARQUE: Si vous utilisez un microscope droit, montez dans l’agarose LMP (semblable à ci-dessus) sur un glissement de couverture en verre. Inverser le couvercle en verre sur une lame de microscope en verre qui a un anneau de graisse sous vide rempli de la même E3-tricaine-PTU.
8. Traiter les images acquises à l’aide de logiciels d’analyse d’images gratuits tels que NIH Image J/FIJI.
   REMARQUE: Comptez les nombres cellulaires et quantifiez les dynamiques telles que la migration cellulaire et la division cellulaire à l’aide d’algorithmes de segmentation et de suivi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000