Agarmontering: En grunnleggende metode for montering av levende sebrafiskembryoer for langtidsavbildning

Overview

Denne videoen beskriver trinnvise instruksjoner om montering av levende sebrafiskembryoer på 6 brønnplater ved hjelp av lavsmelting agarose. Det gir også prosessen å skaffe bilder av levende embryoer og analysere det ved hjelp av programvare.

Protocol

1. Mikroskopoppsett, bildeanskaffelse, behandling og analyse

1. Forbered 0,8% lavt smeltepunkt (LMP) agarose: Tilsett 0,8 g LMP agarose til 100 ml E3 og varm til den er fullstendig oppløst. Mens det var varmt, oppstod aliquot 1 ml LMP i 1,5 ml mikrofugerør i en 37 °C varmeblokk. LMP-agarose forblir smeltet ved 37 °C. Tilsett 40 μl 4 mg/ml (25x), pH 7,0 trikain til hver 1 ml aliquot av LMP agarose ved 37 °C. MERK: Hvis du arbeider med en pigmentert stamme, tilsett 20 μl 0,15% (50x) PTU til hver 1 ml aliquot.
   1. Oppbevar de resterende LMP-agarose i flere måneder i forseglede 50 ml rør ved 4 °C.
2. Bedøv parabiotiske embryoer som skal avbildes ved å tilsette 1 ml 4 mg/ml (25x), pH 7,0 trikain til 25 ml E3 som embryoene allerede er i.
3. Virvle forsiktig parabolen slik at embryoene vil samle seg i midten. Deretter, ved hjelp av en bred tippet plastoverføringspipette, tegner embryoene i så lite væske som mulig. Vri pipetten oppreist og sprett forsiktig embryoene slik at de legger seg til bunnen av pipetten.
   1. Med embryoene på bunnen av pipetten, overfør dem til en 1 ml aliquot av LMP agarose ved å berøre pipettespissen lett til overflaten av agarose. Unngå å overføre overflødig væske, da dette vil fortynne agarose.
4. Etter å ha utvist overflødig væske fra pipetten, bruk pipetten til forsiktig å blande embryoene i agarose, bruk pipetten til å overføre alle agarose og embryoer til brønnen av en glassbunn (nr. 1,5 dekslerlip), 6-brønns plate.
   MERK: Pass på å kaste pipetten etter overføring av embryoene til bildeplaten. Resterende agarose vil sette inne i pipetten, noe som gjør den ineffektiv for videre bruk. Bruk heller en ny pipette hver gang.
5. Under et stereoskop bruker du en gellastende pipettespiss festet på enden av en trehåndtert ertende nål for å plassere embryoene ned mot dekkglasset (for å sikre at de er innenfor mikroskopmålets arbeidsavstand) og i ønsket retning for avbildning.
   MERK: Omplasser kontinuerlig til agarose er fullstendig satt. Pass på å montere de parabiotiske embryoene i henhold til hvilket embryo av paret som skal avbildes. Gitt den tilfeldige orienteringen av de sammenkoblede embryoene, kan det for noen par være vanskelig å avbilde begge embryoene. I dette scenariet gjenoppretter embryoene fra agarose ved hjelp av tang og en bred tippet plastoverføring pipette og deretter remount for avbildning fra et annet perspektiv.
6. Når agarose har satt, dekk med 2 - 3 ml E3 supplert med trikain (og PTU om nødvendig).
7. Se for deg embryoene ved hjelp av en invertert bredfelts epifluorescens, laserskanning konfekt eller spinnende diskkontrokokkmikroskop. Velg målsettingen som passer best for ønsket bildebehandling. For et helt embryo synsfelt, bruk et 4x mål. Velg en høyere forstørrelse, for eksempel en 20x-målsetting, for å avbilde et bestemt vev
   MERK: Hvis du bruker et oppreist mikroskop, monteres det i LMP-agarose (lik ovenfor) på en glassdekselglidning. Snu glassdekslene på et glassmikroskop som har en ring av vakuumfett fylt med samme E3-trikain-PTU.
8. Behandle anskaffede bilder ved hjelp av gratis programvarepakker for bildeanalyse som NIH Image J/FIJI.
   MERK: Telle cellenumre og kvantifisere dynamikk, for eksempel cellemigrering og celledeling, ved hjelp av segmenterings- og sporingsalgoritmer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000