눈 렌즈 해부 : 제브라피시 렌즈 형태를 관찰하는 기술

Overview

이 비디오는 피질 렌즈 형태와 렌즈 봉합사의 구조적 무결성을 분석하기 위해 성인 및 애벌레 얼룩말 렌즈를 해부하기 위해 개발된 프로토콜을 설명합니다.

Protocol

1. 라발 과 성인 얼룩말 피시 렌즈의 해부

1. 6 dpf 애벌레에서 트리카인으로 성인기에 물고기를 마취하여 터치에 반응하지 않지만 여전히 강한 심장 박동을 보여 줍니다. 스테이징을 위해 쉴링(2002)에 따라 어류 표준 길이를 측정합니다.
2. 마이크로 해부 가위를 사용하여 즉시 눈을 소비하고 PBS (성인 눈에 표시된 그림1)에서 해부 접시에 넣습니다.
   1. 렌즈 해부를 위한 실리콘으로 채워진 맞춤형 35mm 접시를 만드십시오. 실리콘이 설정되면 직경 2-3mm, 깊이 0.5mm의 디봇을 소비하여 해부 시 성인 눈/렌즈를 고정합니다.
3. 성인 제브라피시 렌즈 의 해부
   1. PBS로 가득 찬 접시 디봇 후방 쪽에 어른의 눈을 놓습니다. 광학 디스크를 통해 집게를 /lt;45° 각도로 삽입하여 눈을 고정합니다. 렌즈를 닉하거나 압축하지 않도록 주의하십시오. 광디스크에서 해부 가위를 가진 섬모 영역까지 망막과 스클레라를 통해 2~3개의 방사형 절개를 만드세요.
   2. 망막과 꽃잎처럼 껍질을 벗기고 눈을 반전, 각막 측면을 위로. 망막과 부착된 조직을 집게로 당기면서, 가위의 평평한 면으로 클레라와 각막의 조작을 통해 렌즈를 간접적으로 고정시합니다. 렌즈에서 과도한 조직을 조심스럽게 다듬습니다.
      참고: 일관되게 건강한 렌즈를 얻기 위해 신중하게 해부하는 것이 중요합니다.
4. 애벌레 제브라피시 렌즈 해부
   1. PBS로 채워진 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후방 측면을 놓고 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 망막과 경쇄를 통해 방사형 컷을 만드는 동시에 다른 텅스텐 바늘이나 집게로 눈을 고정시십시오.
      참고: 렌즈를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
      1. 와이어 팁을 10%(w/v) NaOH로 일시 중단하고 저전압 교대-전류14를 적용하여 전동적으로 0.1mm 텅스텐 와이어의 2cm 길이의 끝을 선명하게 합니다. 번센 버너를 사용하여 유리 끝을 녹여 파스퇴르 파이펫에 바늘을 고정하십시오.
         참고: 대체 미세 해부 도구도 사용할 수 있습니다.
         주의: NaOH는 부식성입니다.
   2. 바늘의 무딘 면으로 분리 된 눈에서 렌즈를 부드럽게 떠서 부착 된 조직을 조심스럽게 꺼냅니다.

Representative Results

그림 1: 제브라피쉬 렌즈 해부. (A) 눈은 마취된 물고기에서 해부되고 후방 측을 위로 올려 놓습니다(B). (C) 눈은 광학 디스크(od)를 통해 집게에 의해 고정되고, 2~3개의 방사형 절개는 광학 디스크에서 zonules에 이르는 망막및 클클레라로 만들어집니다. (D) 플랩을 접어 렌즈를 드러냅니다. (E) 각막을 향하도록 눈을 돌리고 각막을 통해 렌즈를 간접적으로 고정시키고 clera-망막을 당깁니다. (F) 렌즈에서 남은 망막과 섬모 영역/zonules를 잘라내세요.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A