Tratamento de estreptozocina: Um modelo de zebrafish do diabetes mellitus tipo 1

Overview

Este vídeo descreve a técnica de criar um modelo de zebrafish para diabetes mellitus tipo 1 com a ajuda da droga Streptozocina, para estudar a fisiopatologia de complicações diabéticas e memória metabólica.

Protocol

1. Geração de Zebrafish com Diabetes mellitus, DM Fish

1. Prepare tanto a recuperação quanto os tanques de água anestésicos. Água de recuperação é água normal de peixes. Para a água anestésico adicione 2-fenoxiquitanol suficiente para que uma diluição de 1:1.000 na água normal dos peixes seja alcançada.
2. Prepare uma solução de 0,3% (em um capô de fumaça) de estreptozocina (STZ) adicionando 6 mg de STZ a 2 ml de cloreto de sódio de 0,09% e coloque imediatamente a solução no gelo. Isso fornecerá solução de injeção suficiente para a injeção de aproximadamente 20 peixes em 20 minutos. Se você exceder a marca de 20 minutos, pare e faça uma nova solução STZ antes de prosseguir. Em uma solução salina de tubo separada basta para peixes de controle. Uma vez que o STZ é solubilizado todas as etapas subsequentes não requerem o uso do capô de fumaça.
3. Encha uma seringa de 1/2 cc equipada com uma agulha calibre 27 1/2 com o STZ ou soluções de controle garantindo que nenhuma bolha de ar esteja presa.
4. Anestesiar cada peixe individualmente colocando os peixes em água anestéstica, e esperar até que seu movimento de natação cesse (1-2 min).
5. Uma vez anestesiado, coloque brevemente o peixe em uma toalha de papel para absorver qualquer excesso de água, coloque o peixe no barco de pesagem e meça a massa do peixe.
6. Coloque o peixe em uma superfície firme (tampa da placa de Petri) para injeção.
7. Injete o STZ ou a solução de controle na cavidade peritônica do peixe inserindo a agulha além do bisel no aspecto posterior do peritônio ventral.
8. 0,35 mg/g (350 mg/kg) de STZ deve ser entregue a cada peixe e o volume da solução de 0,3% necessária pode ser calculado da seguinte forma.
   1. Multiplique a massa de peixes (g) por 0,35 para produzir a quantidade de STZ em mg necessária.
   2. dividir o produto gerado acima por 3 para produzir o volume da solução de 0,3% necessária para injeção em μl.
      Amostra: Para um peixe de 0,5 g : a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175/3= 0,058 ml = 58 μl.
      O mesmo volume sem o STZ seria injetado para um peixe de controle. Uma folha para volumes para injetar por massa de peixe deve ser gerada e usada para referência rápida.
9. Após a injeção coloque os peixes no reservatório de água de recuperação e monitore-os para atividade normal de natação. Uma vez alcançado este, os peixes são transferidos para um tanque de vida normal que é mantido na faixa de temperatura reduzida de 22 °C - 24 °C. Esta temperatura reduzida é fundamental para a indução eficiente da hiperglicemia (diabetes mellitus, DM).
10. Embora a hiperglicemia seja detectada dentro de 24 horas da primeira injeção, a fim de induzir um estado prolongado de hiperglicemia muito alta o zebrafish requerem uma fase frequente de indução de injeção seguida de injeções semanais de manutenção, como mostrado abaixo.

Semana 1: 3 injeções (Dia 1, 3, 5), Semana 2: 1 injeção (Dia 12), Semana 3: 1 injeção (Dia 19), Semana 4: (Dia 21) Realizar ensaio de interesse.

Neste ponto, os zebrafish são considerados em um estado prolongado de hiperglicemia e apresentam as complicações diabéticas de retinopatia, nefropatia e também a regeneração de barbatanas prejudicadas. Estes são chamados de peixes DM. Além disso, se desejar, o peixe pode ser mantido em estado hiperglicêmico com injeções semanais de manutenção. Aproximadamente 5% de morte durante esse processo devem ser esperadas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.