Summary
我们描述transcardiac灌注小鼠，拆除和切片的大脑，以及免疫过氧化物酶染色，树脂包埋，和脑切片切片超薄协议。这些程序完成后，免疫染色材料透射电子显微镜检查的准备。
Abstract
透射电子显微镜（TEM）是非常有用的可视化的小胶质细胞，oligodendrocytic，星形胶质细胞和神经细胞的亚细胞（树突棘，枝蔓，轴突，轴突终端，perikaryon），以及他们的细胞器和细胞骨架在中枢神经系统，高空间分辨率。预嵌入免疫细胞化学与透射电镜相结合，允许具有几个鲜明的特点和鉴定标准（例如，小胶质细胞perikarya和流程，当使用一种抗体对小胶质细胞特异性标志物Iba1（钙离子结合适配器分子1的细胞成分的歧视;提出在这里）），识别细胞分子神经递质的内容（如五羟色胺）和可溶性或膜结合的蛋白质的超微结构定位（例如，5 HT1A和EphA4受体）。在这里，我们描述了协议transcardiac灌注小鼠丙烯醛固定液，拆除和大脑切片，以及免疫过氧化物酶 - 二氨基联苯胺（DAB）染色，树脂包埋，以及超薄的脑切片切片。这些程序完成后，免疫染色的材料是用透射电子显微镜检查的准备。如果严格执行，这种技术之间最佳的超微结构的保存及免疫细胞化学检测提供了一个很好的折衷。
Protocol
1。动物灌注
- 在灌注前一天，准备：
- 2 L的磷酸盐缓冲液（PB，100毫米，pH值7.4）和1 L的磷酸钠缓冲液（PBS，0.9％NaCl的50 mM的PB，pH值7.4），双蒸水。存储PB的PBS和1L在4 ° C。这些将被用于灌注和预嵌入免疫细胞化学。
- 1L的4.0％多聚甲醛固定液（煤灰，pH值7.4），这将使灌注6只小鼠。为此，升温1 PB的大号下通风柜。称取40克颗粒多聚甲醛（PFA）的PB液倒入60 ° C，当它到达当该解决方案是明确的，与煤灰完全溶解，冷却至室温（RT）和储存于4 ° C。 - 在灌注的日子，准备在PB 3.5％，丙烯醛的解决方案通风柜下500毫升。然后，过滤器的3.5％丙烯醛和4.0％煤灰的解决方案，用滤纸。
- 对于鼠标麻醉，进入腹膜注入戊巴比妥钠（80毫克/公斤），与一个27号半“针。
- 在灌注，50毫升的PBS，丙烯醛，75毫升和150毫升煤灰将依次传递到鼠标流通。要成立的蠕动泵，填补用PBS管，一端固定在了23号¾“蝴蝶针。油管的另一端浸入灌注液（PBS，丙烯醛或PFA）。蠕动的速度设置泵为20-25毫升/分少年和成年小鼠。整个灌注，小心地避免管路中的空气任何气泡形成。
- 等待，直到不再响应痛苦的刺激，如一条尾巴捏，麻醉鼠标，然后再继续。在解剖盘莱动物和修复使用磁带的爪子。镊子和剪刀，打开皮肤和胸腔，暴露心脏。为了减少脑缺血再灌注的需求将迅速启动。小剪刀剖开右心房，并开始蠕动泵。用镊子按住心脏，左心室心尖的蝴蝶针插入。
- 变化的解决方案时，停止蠕动泵，油管传输到另一个从一个解决方案，并立即重新启动泵。
- 当150毫升煤灰的已经过去了，停止蠕动泵。使用小剪刀，切断头，开放的皮肤，并打破两眼之间的头骨。使用小镊子，小心关闭小块头骨芯片，直到大脑可以很容易地删除。后修复2个小时的大脑在4 °彗星在煤灰。在PBS洗3次，每次10分钟。
- 立即切断在大脑中的横向冷却冰的PBS（50微米厚的部分）使用vibratome。用细刷，转成玻璃小瓶含有PBS的免疫细胞化学选定的部分。存放在冷冻保护剂-20 ° C（30％的乙二醇和30％甘油的PBS）在长达数年的其余部分。
2。预嵌入免疫细胞化学
- 免疫细胞化学，部分处理在玻璃小瓶自由浮动。整个过程中，需要小心避免让部分干出来的。
- 首先，使用移液管取出PBS，并立即更换新鲜的溶液与0.1％PBS中的钠硼氢化物在室温下30分钟。
- 冲洗用PBS 3次10分钟的部分，清除所有气泡，并在室温下2小时孵育的PBS阻断含有0.5％的明胶和5％在二级抗体生成的动物的正常血清（正常山羊血清中的解决方案在目前的Iba1免疫的例子）。
- 在封闭液的主要抗体孵育48小时。 Iba1，免疫，用兔抗Iba1抗体（1:1000）。
- 冲洗，用PBS 3次10分钟的部分，并以生物素标记的第二抗体（1:1000）孵育阻塞解决在室温下2小时。
Iba1，免疫，使用羊抗兔的IgG。 - 冲洗干净，用PBS 3次10分钟的部分和链霉亲和素辣根过氧化物酶（1:1000）孵育阻断在室温下1小时的解决方案。
- 冲洗用PBS 10分钟和部分用Tris /盐酸缓冲液（TBS电视台50毫米，pH值7.4），2次10分钟。为了揭示的标签，孵化，与0.05％民建联和0.01％，在TBS的过氧化氢（溶液新鲜配制）的部分。当染色黑褐色（见图1中的例子），停止反应的TBS冲洗。在任何情况下，最多5分钟后结束反应。冲洗用TBS 10分钟，用PB 2次，每次10分钟的部分。
3。处理电子显微镜
- 部分转移到PB中一个多孔培养板用细刷。福明引擎盖下一个准备1％锇在PB中的四氧化的解决方案。取出培养板井PB和传播的部分，用细刷持平。立即浸入1％为30分钟，在室温下锇部分。
- 转移到玻璃小瓶部分用PB 3次，每次10分钟，冲洗干净，并通过2分钟浸入脱水升序乙醇浓度35％的2倍，1次50％，70％，80％，90％，和95 ％，100％的3倍，3倍环氧丙烷。
- 要准备的Durcupan树脂，结合20克的组件A，B组份为20克，0.6克组件C，0.4克的一次性烧杯ð组件到，拌匀，直到颜色变得均匀，并成为一个铝倒权衡菜。如果需要，可以制备树脂块涌入嵌入模具，并在55 ° C的烤箱48-72小时固化树脂。
- 用细刷与环氧丙烷冲洗，到Durcupan浸渍树脂移除部分环氧丙烷和沉浸在一夜之间，在室温下。
- 翌日，把铝的重量为55 ° C的烤箱10分钟，以软化树脂的菜。使用刷子用环氧丙烷，大衣ACLAR嵌入薄膜的树脂薄层冲洗，放下的部分，与另一嵌入薄膜覆盖，并均匀分布轻的重量（约2 g，例如玻璃瓶，塑料瓶盖）在上面，以帮助树脂蔓延。树脂聚合，培育在48-72小时（在55 ° C）的烤箱。
- 聚合后，取出轻重量和嵌入电影节的顶部。在双目显微镜下，选择感兴趣的方形区域（约2 × 2毫米）和仔细的消费，从他们使用刀片的薄膜。
- 粘在树脂使用的强力胶块尖端领域的兴趣和在55 ° C烘箱固化1小时。
- 在准备为切片，修剪树脂块用刀片的等腰梯形的形状。
- 使用ultramicrotome和玻璃刀，去除组织表面的胶和树脂。填充船的玻璃用双蒸水刀和切几半薄切片（0.5-1微米厚）。
- 的部分转移到一个完美的循环SuperFrost幻灯片。干放置在加热板在80 ° C，1分钟的幻灯片部分。封面的0.1％甲苯胺蓝染色（2克硼酸钠和0.2克甲苯胺蓝在200毫升双蒸水）1分钟几滴。用双蒸水冲洗多余的污渍。与光学显微镜的部分考试将启用树脂（图2），以区别于染色组织。
- 继续切割组织和树脂之间的边界，直到达到中间部分。注意：下面的过程，需要培训。更换玻璃用钻石刀的刀，并填写用双蒸水船。切断银银金超薄切片（60-80纳米厚），并认真收集铜网，用细倒镊子电网。干滤纸上的网格。
- 为了提高对比度，超薄切片，可染色柠檬酸铅（0.03克柠檬酸铅和0.1毫升10毫升双蒸水1 10N氢氧化钠）。使用罚款倒镊子，转移到2分钟，柠檬酸铅下降一格。删除电网和微妙连续3双蒸水浴场冲洗。最后，干燥的滤纸上的电网，并存储在网格中，直到电子显微镜检查（图3-6）。
4。代表性的成果
图1。Iba1染色在光镜水平的部分。 Iba1蜂窝分布仅限于小胶质细胞，这表明，特异性的免疫。比例尺= 100微米。
图2，甲苯胺蓝染色半薄切片在光镜下水平。注意组织和树脂之间的边界将出现在电子显微镜的免疫最激烈的。
图3。超薄切片显示在电子显微镜水平Iba1免疫阳性胶质细胞perikaryon和流程。 Iba1阳性结构要素是公认的免疫过氧化物酶- DAB电子致密沉淀。比例尺= 2微米。
图4。超薄切片显示在电子显微镜水平Iba1小胶质细胞免疫反应过程的不同大小和形状。比例尺= 2微米。
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图5。超薄切片显示在更高的放大倍率从图4中的一个Iba1阳性的小胶质细胞的过程，使细胞器的识别。比例尺= 1微米。
图6。超薄切片揭示在更高的放大倍率之间Iba1阳性小胶质细胞的过程中和附近的神经纤维元素，包括突触的超微结构的关系。比例尺=1μm的。
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Discussion
在这里，我们描述了小鼠脑组织的准备，免疫电镜，最佳的超微结构的保存及免疫细胞化学检测时严格执行程序之间提供了一个很好的折衷协议。
用透射电子显微镜相结合，这种方法可以区分具有几个鲜明的特点和鉴定标准的蜂窝元素。特别是，Iba1免疫过氧化物酶- DAB染色，使确定的小胶质细胞perikarya和流程内的神经纤维，以及分析它们的形态，细胞器超微结构的关系，并与其他细胞成分（图3-6）。此外，该协议允许可溶性或膜结合蛋白在胶质细胞或神经元元素分析超微结构的位置，以及它们与细胞内的细胞器协会。事实上，使用特异性抗体的这个协议，我们先前发现的5 - HT1A和5 - HT1B - 羟色胺受体的神经元perikarya，树突，树突棘，无髓鞘的轴突，内皮细胞和成年大鼠中缝背核，substantia超微结构定位黑质，苍白球，海马2。我们还表明EphA4和EphB2的酪氨酸激酶受体在网格蛋白涂层的囊泡和不同的星形胶质细胞和神经元在小鼠和大鼠海马和大脑皮质超微结构定位，在出生后发育和成年3,4,5,6。最后，该协议可以结合预嵌入免疫分析超微结构两个同时标记的蛋白之间的关系，例如Vglut1谷氨酸转运和EphA4受体在成年小鼠大脑皮质6的轴突终端的合作本地化。因此，这种技术可以成功地应用，单独或与免疫胶体金标记的组合，各种蛋白质在中枢神经系统的不同地区，不同类型的细胞超微结构的分析，整个产后生活，在健康和疾病。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢少明路和哈里斯答：格尔巴德蠕动泵和vibratome的使用，以及在电子显微镜下研究的罗切斯特大学医学中心为技术援助的核心设施，克伦L. Bentley和盖尔施耐德。这项工作是由来自美国国立卫生研究院（EY019277），白厅基金，宝来惠康基金，和艾尔弗雷德斯隆基金会的AKM的资助。 M.-È.T.是由一个全宗RECHERCHE EN桑特魁北克（FRSQ）博士后奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
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References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
