Beredning av Mouse hjärnvävnad för Immunoelectron mikroskopi

Summary

Vi beskriver ett protokoll för transcardiac perfusion av möss, demontering och sektionering av hjärnan, samt immunofluorescensteknik färgning, harts inbäddning och supertunna sektionering av hjärnan sektioner. Efter slutförandet av dessa förfaranden, är immunostained materialet redo för undersökning med transmissionselektronmikroskopi.

Abstract

Transmissionselektronmikroskop (TEM) är mycket användbar för att visualisera microglial, oligodendrocytic, astrocytic och neuronala subcellulära fack (Dendrite, dendritiska ryggrad, axonet, axonet terminal, perikaryon), samt deras intracellulära organeller och cytoskelettet, i det centrala nervsystemet vid hög rumslig upplösning. I kombination med TEM, kan pre-inbäddning immuncytokemi diskriminering av cellulära element med några särdrag och kriterier legitimation (t.ex. microglial perikarya och processer, när du använder en antikropp mot mikroglia-specifik markör Iba1 (joniserat kalcium bindande adapter molekyl 1, som presenteras här)), identifiera signalsubstansen innehållet av cellulära element (t.ex. serotonerga) och deras ultrastrukturella lokalisering av lösliga och membranbundna proteiner (t.ex. 5 HT1A och EphA4 receptorer). Här beskriver vi ett protokoll för transcardiac perfusion av möss med Akrolein fixativ, borttagning och sektionering av hjärnan, samt immunofluorescensteknik-Diaminobenzidin (DAB) färgning, harts inbäddning och supertunna sektionering av hjärnan sektioner. Efter slutförandet av dessa förfaranden, är immunostained materialet redo för undersökning med TEM. När rigoröst utföras, ger denna teknik en utmärkt kompromiss mellan optimal ultrastrukturella bevarande och immuncytokemiska upptäckt.

Protocol

1. Animal perfusion

1. På dagen innan perfusion, förbereda:
   - 2 L fosfatbuffert (PB, 100 mm, pH 7,4) och 1 l av natriumfosfat-saltlösning (PBS, 0,9% NaCl i 50 mm PB, pH 7,4) i dubbeldestillerat vatten. Förvara PBS och 1L av PB vid 4 ° C. Dessa kommer att användas för perfusion och pre-inbäddning immuncytokemi.
   - 1L på 4,0% paraformaldehyd (PFA, pH 7,4) fixativ lösning som gör det möjligt att genomblödningen i 6 möss. För detta ändamål, hetta upp 1 L i PB I ett dragskåp. Väg 40 g av granulat paraformaldehyd (PFA) och häll i PB lösningen när den når 60 ° C. När lösningen är klar, med PFA helt upplöst, svalna till rumstemperatur (RT) och förvara vid 4 ° C.
2. På dagen av perfusionen, förbereda 500 ml 3,5% akrolein lösning i PB I ett dragskåp. Sedan filtrera 3,5% akrolein och 4,0% PFA lösningar med hjälp av filtrerpapper.
3. För musen anestesi, injicera natrium pentobarbital (80 mg / kg) i bukhinnan med en 27 gauge ½ "nål.
4. Under perfusion, 50 mL PBS, kommer 75 ml Akrolein, och 150 ml av PFA passera sekventiellt i musen cirkulationen. För att ställa in peristaltiska pumpar, fyll slangen med PBS och fixa en 23 gauge ¾ "butterfly nål i ena änden. Sänk den andra änden av slangen i perfusion lösningen (PBS, akrolein eller PFA). Ställ in hastigheten på peristaltiska pump till 20-25 ml / min för unga och vuxna möss. Alltigenom perfusionen, omsorgsfullt undvika luftbubblor bildas i slangen.
5. Vänta tills nedsövd musen reagerar inte längre på smärtsamma stimuli, till exempel en svans nypa, innan du fortsätter. Lägg djuret i en dissektion fack och fixa tassarna med tejp. Med pincett och sax, öppna upp huden och bröstkorgen att exponera hjärtat. För att minimera hjärnischemi behöver perfusionen ska startas snabbt. Skär öppna höger förmak med en liten sax och starta peristaltiska pumpen. Håll hjärtat med pincett, sätt fjärilen nålen i spetsen av vänster kammare.
6. När du byter lösning, stoppa peristaltiska pumpar, överföring slangen från en lösning till en annan, och starta om pumpen omedelbart.
7. När 150 ml PFA har passerat, stoppa peristaltiska pumpen. Med små saxar, skär av huvudet, öppna upp huden, och bryter skallen mellan ögonen. Med små pincetter, försiktigt chip bort små bitar av skallen tills hjärnan kan enkelt tas bort. Post-fix hjärnan i 2 timmar vid 4 ° C i PFA. Tvätta 3 gånger 10 minuter i PBS.
8. Omedelbart skär hjärnan i tvärgående (50 ìm tjocka sektioner) i is-kylda PBS med hjälp av en vibratome. Med en fin pensel, överföring sektioner väljs för immuncytokemi i en injektionsflaska av glas som innehåller PBS. Förvara de återstående avsnitten vid -20 ° C i frysskyddsmedel (30% etylenglykol och 30% glycerol i PBS) i upp till flera år.

2. Pre-inbäddning immuncytokemi

1. För immuncytokemi, är avsnitt behandlas fritt flytande i glasflaskor. Under hela förfarandet, måste man noggrant undvika att låta delar torka ut.
2. Först bort PBS med hjälp av en pipett och omedelbart ersätta med en ny lösning av 0,1% natrium borohydride i PBS i 30 minuter vid RT.
3. Skölj delarna med PBS 3 gånger 10 minuter, ta bort alla bubblor, och inkubera i 2 timmar vid strålbehandling i en blockerande lösningen av PBS som innehåller 0,5% gelatin och 5% normala serum av de djur vars sekundär antikropp genererades (normal get serum i det nuvarande exemplet på Iba1-immunfärgning).
4. Inkubera under 48 timmar med primär antikropp i blockerande lösningen. För Iba1-immunfärgning, använd kanin anti-Iba1 antikropp (1:1000).
5. Skölj delarna med PBS 3 gånger 10 minuter och inkubera vid sekundär antikropp konjugerad med biotin (1:1000) i blockerande lösningen för 2 timmar vid RT.
   För Iba1-immunfärgning använder get-anti-kanin IgG.
6. Skölj delarna med PBS 3 gånger 10 minuter och inkubera i streptavidin-pepparrotsperoxidas (1:1000) i blockerande lösningen i 1 timme vid RT.
7. Skölj delarna med PBS 10 minuter och med Tris / HCl-saltlösning (TBS, 50 mm, pH 7,4) 2 gånger 10 minuter. Att avslöja märkning, inkubera sektioner med 0,05% DAB och 0,01% väteperoxid i TBS (lösning nyberedd). När färgningen är mörkbrun (se exempel i figur 1), Stoppa reaktionen genom att skölja i TBS. I varje fall avsluta reaktionen efter högst 5 minuter. Skölj sektioner med TBS 10 minuter och med PB 2 gånger 10 minuter.

3. Behandling för elektronmikroskop

1. Överför sektioner i PB i ett multispot odlingsplatta med en fin pensel. Bered 1% lösning osmium Tetroxide i PB under en rykande huva. Ta PB från brunnarna av kulturen plattan och sprida delar lägenhet med en fin pensel. Omedelbart fördjupa avsnitt i 1% osmium i 30 minuter vid RT.
2. Överför sektioner i glasflaskor, skölj med PB 3 gånger 10 minuter, och torkar genom 2 minuter dykningar till stigande halter av etanol: 2 gånger 35%, 1 gång vardera 50%, 70%, 80%, 90%, och 95 %, 3 gånger 100%, följt av 3 gånger propylenoxid.
3. För att förbereda Durcupan harts, kombinera 20 g komponent A, blanda 20 g av komponent B, 0,6 g komponent C, och 0,4 g del D till en disponibel bägare, väl tills färgen blir enhetlig, och häll i en aluminium väger maträtt. Vid behov kan kåda block beredas genom att hälla massan till inbäddning formar och härdning i en 55 ° C ugn i 48-72 timmar.
4. Med hjälp av en fin pensel sköljas med propylenoxid, ta bort delar från propylenoxid och fördjupa in i Durcupan harts för impregnering övernattning på RT.
5. Följande dag lade aluminium väger skålen i en 55 ° C ugn i 10 minuter för att mjuka upp harts. Med en borste sköljas med propylenoxid, pälsen en ACLAR bädda film med ett tunt lager harts, fastställa sektioner, täck med en annan inbäddning film och fördela lätta vikter (ca 2 g, till exempel av plastsnäpplocken av glas flaskor) på toppen för att hjälpa harts spridning. För harts polymerisation, inkubera i ugnen i 48-72 timmar (vid 55 ° C).
6. Efter polymerisering, ta bort lätta vikter och bädda in filmen på toppen av avsnitten. Enligt en kikare mikroskop, välj kvadrat områden av intresse (ca 2x2 mm) och försiktigt punktskatter dem från filmen med hjälp av ett rakblad.
7. Limma områden av intresse vid spetsen av kåda block med Superlim och bota i 55 ° C ugn i 1 timme.
8. Som förberedelse för sektionering, trimma harts blocket till formen av en likbent parallelltrapets med ett rakblad.
9. Använda en ultramicrotome och ett glas kniv, ta bort lim och harts på ytan av vävnaden. Fyll båten av glaset kniven med dubbel destillerat vatten och skär ett par semi-tunna (0.5-1 ìm tjock).
10. Överför avsnitt för att en SuperFrost bild med en perfekt slinga. Torka delarna genom att placera bilden på en värmeplatta vid 80 ° C under 1 minut. Täck med några droppar 0,1% toluidinblått bets (2 g natriumborat och 0,2 g toluidinblått i 200 ml dubbeldestillerat vatten) i 1 minut. Skölj överskottet fläcken med dubbla destillerat vatten. Undersökning av sektioner med ett ljusmikroskop gör det möjligt att skilja det färgade vävnad från harts (Figur 2).
11. Återuppta skära tills gränsen mellan vävnaden och harts når mitten av avsnitten. Observera att följande procedur kräver utbildning. Byt ut glaset kniv med en diamant kniv och fyll båten med dubbla destillerat vatten. Klipp silver till silver-guld ultratunna avsnitt (60-80 nm tjockt) och noggrant samla in dem på galler koppar mesh med fina inverterade pincett. Torka näten på ett filtrerpapper.
12. För att öka kontrasten kan supertunna sektioner färgas med bly citrat (0,03 g bly citrat och 0,1 ml 10N natriumhydroxid i 10 ml dubbeldestillerat vatten ^1). Använda fina inverterad pincett, överföra ett rutnät till en minskning av bly citrat i 2 minuter. Ta bort gallret och fint skölj i tre på varandra badet i dubbel destillerat vatten. Slutligen torka näten på ett filterpapper och lagra dem i ett rutnät lådan tills elektron mikroskopisk undersökning (figur 3-6).

4. Representativa resultat

Figur 1. Iba1-färgade avsnitt i ljuset mikroskopisk nivå. Det cellulära distributionen av Iba1 är begränsad till mikroglia, som visar specificitet immunfärgning. Skala bar = 100 ìm.

Figur 2. Toluidine blå-färgade halv-tunn sektion i ljuset mikroskopisk nivå. Observera gränsen mellan vävnaden och harts där immunfärgning kommer att visas som mest intensiv i elektronmikroskop.

Figur 3. Ultratunn avsnitt visar Iba1-immunopositive microglial perikaryon och processer på elektronen mikroskopisk nivå. Iba1-positiva strukturella element identifieras genom immunofluorescensteknik-DAB elektron-täta fällning. Skala bar = 2 ìm.

Figur 4. Ultratunn avsnitt visas Iba1-immunopositive microglial processer av olika storlekar och former på elektronmikroskopiska nivå. Skala bar = 2 ìm.

e 5 "/>
Figur 5. Ultratunn avsnitt som visar på högre förstoring en Iba1-positiv microglial processen från figur 4, vilket möjliggör identifiering av de intracellulära organeller. Skala bar = 1 mm.

Figur 6. Ultratunn avsnitt avslöjande i högre förstoring i ultrastrukturella relationer mellan en Iba1-positiv microglial process och närliggande delar av neuropil inklusive synapser. Skala bar = 1μm.

Discussion

Här har vi beskrivit ett protokoll för förberedelser av mus hjärnvävnad för immunoelectron mikroskopi som ger en utmärkt kompromiss mellan optimal ultrastrukturella bevarande och immuncytokemiska upptäckt, när de förfaranden som rigoröst utförs.

I kombination med TEM, möjliggör denna metod för att skilja cellulära element med några särdrag och kriterier identifiering. I synnerhet möjliggör immunofluorescensteknik-DAB färgning av Iba1 att identifiera microglial perikarya och processer inom neuropil, samt att analysera deras morfologi, intracellulära organeller och ultrastrukturella relationer med andra cellulära element (figur 3-6). Dessutom ger detta protokoll analysera ultrastrukturella platser av lösliga och membranbundna proteiner i gliaceller eller neuronala inslag, liksom deras samarbete med intracellulära organeller. I själva verket, med hjälp av detta protokoll med specifika antikroppar har vi avslöjat tidigare ultrastrukturella lokalisering av 5-HT1A och 5-HT1B serotonerga receptorer i neuronala perikarya, dendriter, Dendritutskotten, unmyelinated axoner, och endotelceller hos vuxna råttor Raphe dorsalis kärna, substantia nigra, globus pallidus, och hippocampus ^2. Vi har också visat på ultrastrukturella lokalisering av EphA4 och EphB2 tyrosinkinas-receptorer i clathrin-belagda vesiklar och olika astrocytic och neuronala element i mus och råtta hippocampus och hjärnbarken under utveckling efter födsel och vuxen ålder ^3,4,5,6. Slutligen kan detta protokoll kombineras med pre-inbäddning immunogold att analysera ultrastrukturella relationen mellan två samtidigt märkta proteiner, till exempel co-lokalisering av Vglut1 glutamaterg transportör och EphA4 receptorn i axonet terminaler för vuxna musen hjärnbarken ^6. Därför kan denna teknik framgångsrikt användas, ensamt eller i kombination med immunogold märkning, för ultrastrukturella analys av olika proteiner i olika regioner och celltyper i centrala nervsystemet, hela postnatal liv, hälsa och sjukdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium pentobarbital (Nembutal)	OVATION Pharmaceuticals
Filter paper 315 24 cm	VWR international	28331-081
*Acrolein purum (≥95%)	Sigma-Aldrich	01680
Sodium borohydride (≥98%)	Sigma-Aldrich	452173
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%)	Sigma-Aldrich	441244
Normal goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Rabbit anti-Iba1 primary antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	019-19741	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific	Jackson ImmunoResearch	111-066-046	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Peroxidase-conjugated streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-030-084	Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
*Osmium tetroxide 4% solution	Electron Microscopy Sciences	19150	Light sensitive
Propylene oxide (≥99%)	Sigma-Aldrich	82325
Polypropylene disposable beakers (50 mL)	Fisher Scientific	01-291-10
Aluminium weigh dishes (70 mm)	Fisher Scientific	NC9261784
Durcupan epoxy resin	Electron Microscopy Sciences	14040
Embedding mold	Electron Microscopy Sciences	70907
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	44581
Gelatin subbed slides	VWR international	100241-864
ACLAR embedding films (7.8 mm)	Electron Microscopy Sciences	50425
Capsule mold	Electron Microscopy Sciences	70150
High-performance super glue	Corporate Express	LOC30379
Perfect loop for ultra thin sections	Electron Microscopy Sciences	70944
Superfrost slides	Fisher Scientific	22-178-277
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm)	Diatome
Gelatin from cold water fish skin (~45%)	Sigma-Aldrich	G7765
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.