Overview
סרטון זה מתאר את הניתוק הלא אנזימטי של רקמה אנושית טרייה כדי להשיג תאים בני קיימא. הטכניקה משמשת לניתוח איכותי כמותי של תאים חיוביים CD45 (לימפוציטים / לויקוציטים) הנמצאים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות.
Protocol
1. הכנת הרקמה הומוגנטית
- ניתוח רקמות מנוכות (רקמות ממאירות ונורמליות שהושלכו מחדר הניתוח) נמצאות במעבדה הפתולוגית על ידי כוח אדם מיומן לאיסוף מיידי. גידול, NANT (נלקח את המרחק הרחוק ביותר מן הגידול ככל האפשר) שברי רקמות נורמלי מעובדים באופן שגרתי בתוך 1 - 3 שעות של כריתה כירורגית במעבדה BSL2 באמצעות הליכים biosafety סטנדרטי עבור רקמות אנושיות. תרשים זרימה של הפרוטוקול מאויר באיור 1.
- שוקלים את כל שברי הרקמות (רגיל, NANT וגידול) ומודדים את האורך, הרוחב והגובה (אורך x רוחב x גובה). זהו צעד חשוב לנורמליזציה הבאה של תת-אוכלוסיות תאים, רנ"א שחולץ וכו '.
שים לב: טווח גודל המדגם הוא 100 עד 10,000 מ"מ3 ללא שומן במידת האפשר. - להטביע את שבר הגידול על שקופית זכוכית עבור כתמי H&E כדי לוודא כי הרקמה היא למעשה חלק מהגידול.
- עשה זאת על ידי לחיצה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית על שבר הגידול והפעלת לחץ עדין עם האצבעות במשך כמה שניות.
- לתקן את המגלשה עם isopropanol במשך 2 דקות ואחריו שלב כביסה במים. נגד הכתים את הרקמה למשך 30 שניות עם המטוקסילין של מאייר.
- שטפו את המגלשה בשש אמבטיות מים. כתם בפלוקסין B 2% למשך 15 שניות.
- לשטוף באמבט אחד של מים ואחריו ארבע אמבטיות של isopropanol ולסיים עם אמבטיה אחת של מים.
- דגירה ב isopropanol במשך 1 דקות לנקז. נקי בשתי אמבטיות של קסילן.
- הרכבה עם מדיום הרכבה מבוסס xylene. בדוק אם יש תאיות גידולית (איור 2).
שים לב: בעיקר, תאים סרטניים נדבקים לשקופית המוטבעת - תאי הסטרומל, הלימפה או השומן נשארים לעתים רחוקות, ומשאירים רווחים בין תאי הגידול(איור 2).
- מניחים את שבר הרקמה בצלחת תרבות קטנה המכילה 1 מ"ל של מוגדר כימית, בינוני תא hematopoietic ללא סרום (להלן המכונה בינוני) בטמפרטורת החדר קוביות אותו לחתיכות קטנות (~ 1 - 2 מ"מ2) באמצעות אזמל סטרילי.
- להעביר הכל (שברי רקמה + בינוני) לצינור ניתוק מכני C.
- שוטפים את צלחת פטרי ואזמל עם 2 מ"ל של מדיום באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף את זה צינור C (נפח של בינוני עבור דיסוציאציה = 3 מ"ל).
- השתמש בתוכנית דיסוציאטור מכני A.01 עבור צינורות C (התוכנית העדינה ביותר) כדי הומוגניזציה שברי הרקמה לתוך השעיה תא יחיד. מניחים את צינור C במנגנון ולהפעיל את התוכנית פעמיים ברציפות (מחזור אחד = 25 שניות).
שים לב: הליך הומוגניזציה זה הוקם ואמת עבור רקמת השד האנושית, סוגים אחרים של גידול או רקמות ייתכן שיהיה צורך להשתמש בתוכנית אחרת ויש לבדוק תחילה. - הסר את צינור C מהמנגנון ו decant הומוגנט ישירות לתוך מסננת תאים 40 מיקרומטר יושב על צינור 50 מ"ל. באמצעות אותו פיפטה פסטר כמו בשלב 1.6, להעביר כל נוזל שנותר בצינור C למסננת התא.
- מעבירים את הנוזל המסונן לצינור של 15 מ"ל בעזרת קצה מיקרופיפט של 1 מ"ל. באופן זמני לשמור על מסננת התא שלה צינור 50 מ"ל.
- לשטוף את הצינור C עם 3 מ"ל נוספים של בינוני ולהעביר את זה, שוב באמצעות פיפט פסטר אותו כמו בשלב 1.6, כדי מסננת התא עדיין יושב על הצינור 50 מ"ל. לסחוט כמות מקסימלית של נוזל שיורית לכודים ברקמה unhomogenized לתוך הצינור 50 מיליליטר על ידי בעדינות להזיז אותו סביב מסננת עם פיפטה פסטר נקי או 1 קצה מיליליטר כי הוא נזרק לאחר מכן משם, כדי למנוע זיהום ההבראה.
- מניחים את מסננת התא במהופך על צינור C המקורי ולשטוף עם 3 מ"ל של מדיום, כך הרקמה unhomogenized טיפות בחזרה לתוך הצינור C.
- הומוגניזציה מחדש כמו בשלב 1.7 עבור שני מחזורים של תוכנית A.01.
- יוצקים את ההומוגנט השני דרך מסננת התאים היושבת על צינור 50 מ"ל, שוטפים שוב את צינור C עם 3 מ"ל בינוני (כמו בשלב 1.10)ומעבירים עם פיפט פסטר למסננת התא היושבת על צינור 50 מ"ל שוב סוחטת כמות מקסימלית של נוזל מרקמת החיבור השיורית שנלכדה במסננת התאים.
- בשלב זה, נפח של ~ 2.5 מ"ל הוא בצינור 15 מ"ל ו ~ 9 מיליליטר בצינור 50 מ"ל.
2. הפרדת הרקמה Supernatant ותאים
- צנטריפוגה homogenates בצינורות 15 מיליליטר ו 50 מ"ל במשך 15 דקות ב 600 x גרם בטמפרטורת החדר.
- דסנט SN מצינור 15 מ"ל לתוך צינור נקי ולאחסן באופן זמני ב 4 מעלות צלזיוס. זה supernatant = גידול ראשוני, NANT או SN רקמה נורמלית (נפח סופי 2.5 מיליליטר) לאחר מכן מובהר ו aliquoted לפני אחסון ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים עתידיים (ראה להלן).
- השלך את supernatant מצינור 50 מ"ל.
- בעדינות resuspend שני כדורי התא בנפח סופי של 1 מ"ל בינוני. בקצרה, תחילה בעדינות לשבור את גלולת התא בשני הצינורות (על ידי הקשה על הצינור על משטח קשה). Resuspend גלולת התא רופף ב 50 מ"ל עם 500 μl של בינוני ולהעביר את ההשעיה תא זה צינור 15 מיליליטר כדי resuspend את הכדור השני. חזור על שלב זה פעם אחת עם השני 500 μl של בינוני להתאוששות מקסימלית של תאים.
- העבר 10 μl של השעיית התא לצינור קטן, לערבב עם 10 μl של כחול trypan (דילול 1:1) ולספור את מספר התאים קיימא באמצעות hemocytometer.
שים לב: בשלב זה חלק קטן של השעיית התא יכול גם להיות מנותח על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את גודל התא, צפיפות ואם תרצה מספר מוגבל של סמני תת-אוכלוסין להערכה מדויקת יותר של התפלגות התאים היחסית בהומוגנט לפני ניתוח מקיף או ניסויים. כל הניתוחים על ידי cytometry זרימה לשלב תיוג CD45 לנורמליזציה של תת-אוכלוסין. - גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. התאים מהגידול, NANT, או רקמה נורמלית מוכנים כעת לטיהור נוסף או ניתוח. צעדים נוספים אלה הם הטובים ביותר כאשר מבוצע באותו יום כמו ניתוח.
שים לב: עבור ניתוח ציטומטרי זרימה אבל לא תא מיון כדוריות הדם האדומות שיורית צריך להיות lysed לאחר תיוג נוגדן על ידי הוספת 0.4 מיליליטר של מאגר תמוגה של תאי דם אדומים לכדור התא, מיד מערבולת במשך 1 שניות דגירה מינימום של 10 דקות בטמפרטורת החדר (מוגן מפני אור) לפני הניתוח.
3. הבהרה של הרקמה Supernatant
- צנטריפוגה צינורות 1.5 מ"ל עם SN רקמה ב 15,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בזהירות להסיר את supernatant מבלי לגעת או להפריע גלולה. העבר לצינור נקי (או צינורות) בהתאם למספר ונפח של aliquots הרצוי.
- אחסן את supernatant ב -80 °C (60 °F) לשימוש עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: תרשים זרימת פרוטוקול. ההליך שלנו לעיבוד רקמות אנושיות טריות וכמה גישות אנליטיות שניתן להשתמש בהן לאחר מכן כדי להעריך לימפוציטים החודרים לרקמות אנושיות מוצגים.
איור 2: תמונה מוכתמת H&E של חותם רקמת גידול בשד. חותם זה, שנלקח מרסיס רקמת גידול שד טרי, מראה את נוכחותם של תאים סרטניים עם השטחים הפתוחים המשקפים אזורים שלא הועברו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
Bürker Chamber Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer | |
Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | 510 | or standard single use sterile scalpel |
BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |