मेटाबोलोमिक्स के लिए नमूना तैयारी: मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए सेल नमूने तैयार करने के लिए एक विधि

Abstract

स्रोत: झाओ, वाई.C एट अल., स्तन कैंसर में एस्ट्रोजन रिसेप्टर सिग्नलिंग द्वारा मेटाबोलिक विनियमन के सिस्टम जीव विज्ञान । जे विस Exp। (2016).

इस वीडियो में मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए ब्रेस्ट कैंसर सेल के नमूने तैयार करने की तकनीक का वर्णन किया गया है। स्तन कैंसर कोशिकाओं का इलाज एस्ट्रोडियोल से किया जाता है, जो एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा को बांधता है और मेटाबोलाइट संरचना में बदलाव का कारण बनता है।

Protocol

1. मेटाबोलोमिक्स परख नमूना तैयारी

1. सेल संस्कृति और उपचार
   1. बीज 400,000 MCF7 कोशिकाओं प्रति 10 सेमी प्लेट विकास माध्यम में. प्रत्येक उपचार के लिए तीन नमूने तैयार करते हैं। पता लगाने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने में दो प्लेटों का उपयोग करें। तीसरे दिन, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं में 10^-8 एम एस्ट्रडिओल या ई 2 के साथ या उसके बिना 5 मिलीलीटर ताजा माध्यम जोड़ें। 24 घंटे (आर्द्रीकृत 5%_सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस) के लिए कोशिकाओं का इलाज करें।
2. नमूना संग्रह
   1. प्लेट में 5 मिलीलीटर बर्फ ठंड 1x पीबीएस जोड़ें, कई बार प्लेट को संक्षेप में झुकाने के बाद पीबीएस को एस्पिरेट करें। दो बार दोहराएं, और पिछले धोने के बाद जितना संभव हो उतना पीबीएस निकालें।
   2. प्रत्येक प्लेट में प्री-कोल्ड एसीटोन का 750 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को परिमार्जन करें। कोशिकाओं को एसीटोन में दो प्लेटों से बर्फ पर 2 मिलीलीटर ट्यूब में मिलाएं।
   3. सामान्यीकरण के लिए सेल काउंट
      1. प्रत्येक उपचार के लिए, सेल क्वांटिफिकेशन के लिए दो अतिरिक्त प्लेटों का उपयोग करें। प्लेट से कोशिकाओं को डी-अटैच करने के लिए, प्रत्येक प्लेट में 2 मिलीलीटर एचई बफर (1x एचबीबीएस, 10 एमएम एचईपीई, 0.075% नाएचसीओ_3, और 1 एमएम ईडीटीए) जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      2. वह बफर में कोशिकाओं को पाइपिंग करके कोशिकाओं को अच्छी तरह से इकट्ठा करें और मिलाएं। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर गिनने के लिए कुल 20 माइक्रोल सेल समाधान का उपयोग करें।
3. गैस क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) विश्लेषण का उपयोग करके मेटाबोलाइट्स की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए मेटाबोलोमिक्स केंद्र में भेजने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।