Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Summary

Este artículo describe un método para microdissect retinas del pez cebra con y sin epitelio pigmentario de la retina adjunta, de uno a tres embriones postfertilización días.

Abstract

Pez cebra es un modelo animal popular para la investigación sobre el desarrollo del ojo, debido a su rápida

Protocol

Parte 1: Preparativos antes de microdisección

1. Soluciones
   1. E3 medio ⁴ (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl ₂ y 0,33 mM MgSO _4).
   2. Solución de Ringer ^{1, 5} (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH 7.2), esterilizado por filtración.
   3. NaOH 5N.
2. Ataque químico de las agujas de tungsteno
   1. Asegurar un pequeño vaso que contiene NaOH 5 N en una placa de Petri de arcilla.
   2. Adjuntar un clip de papel en el lado del vaso, por lo que entra en contacto con la solución de NaOH.
   3. Conecte el electrodo negativo de una fuente de alimentación de CC en el clip y el electrodo positivo a un extremo de una pieza corta (~ 2 cm) de alambre de tungsteno.
   4. Envuelva el otro extremo del alambre de tungsteno con una bola de arcilla y sumergir este extremo en la solución de NaOH.
   5. Aumentar la tensión a unos 3V y sumergir el hilo hacia arriba y abajo en la solución de NaOH hasta una velocidad de grabado bien se alcanza. Una aguja en buena calidad por lo general puede ser grabada en 10 minutos.
   6. El alambre de tungsteno expuesta a la disolución se volverá gradualmente más delgada. Cuando la bola de arcilla cae, el otro lado del alambre que está todavía en el electrodo positivo tendrá una forma aguja.
   7. Enjuague la aguja con solución de Ringer o E3 para eliminar los depósitos de sal.
   8. Ponga la aguja en un aplicador de madera con una cinta o un soporte de aguja para un fácil manejo.
3. Placas de cultivo
   1. El Falcon 60 x 15 mm y placas de cultivo de poliestireno están listos para usar para la microdisección de retina.
   2. Para la disección de RPE-adjunto retina, aplastar a dos embriones por completo en una placa de cultivo con solución de Ringer para deshacerse de la adherencia de la superficie de 30 minutos antes de la disección. Poco antes de la disección, se lava la placa extensamente con solución de Ringer fresca.
4. Los embriones de recogida y puesta en escena
   1. Adultos de pez cebra se mantienen tal como se describe ^{4, 5.}
   2. Separar los peces de los padres en los tanques de cría estática pares por un divisor de la noche antes de la reproducción.
   3. Quitar el divisor después de la luz de la habitación se enciende en la mañana siguiente. Permiten que los padres se cruzan en intervalos de 10 minutos cada media hora. Separar el pescado después de cada cruce.
   4. Mantener los embriones obtenidos de cada cruce en el medio de E3 por separado a 28 ° C.
   5. Embriones etapa de 10 a 12 horas después de la fecundación (HPF) y re-escenificar inmediatamente antes de la disección en los puntos de tiempo específicos, de acuerdo con los criterios establecidos ^{1, 6.}

Parte 2: Disección - la extracción del cerebro y ^una exposición de los ojos

• Los procedimientos descritos en esta sección son comunes para la disección de la retina (la parte 3A) y RPE-adjunto retina (parte 3 B).
• Todas las disecciones bien se realiza por un extremo de la pinza Dumont y con la asistencia de otro par de pinzas Dumont para el posicionamiento del tejido. Una aguja de tungsteno químicamente grabados se pueden utilizar para la manipulación más fina si es necesario.
• Todas las disecciones bien se llevan a cabo con un aumento de ~ 5-8x en una Olympus SZX16 microscopio equipado con un objetivo 1X o equivalente.
• Mantener los embriones en un medio de E3 en una mesa de laboratorio incubadora a 28 ° C al lado del microscopio para el acceso fácil embrión durante la disección.
• La platina del microscopio se calienta a 28 ° C con una placa térmica para reducir al mínimo la influencia de la fluctuación de la temperatura sobre la expresión génica.

1. La transferencia de un embrión en una etapa de desarrollo específicas para la solución de Ringer en un Falcon 60 X 15 mm placa de cultivo preparado como se describe en la Parte 1 # 3.
2. Le cortó la cabeza con la parte del tronco anterior rápidamente del cuerpo.
3. Pin el extremo posterior de este tejido en la placa de cultivo con las pinzas de la asistencia.
4. Abrir la cabeza en la parte dorsal a partir de la frente anterior.
5. Retire el cerebro de manera que la cara medial de los ojos está expuesto y es hacia arriba para otras manipulaciones.

Parte 3A: la disección de ^una retina

1. Preparar el embrión como se describe en la Parte 2.
2. Con cuidado, cepillo de la RPE expuestos en la parte media del globo ocular que es hacia arriba por la punta de la pinza hasta que una pequeña abertura en la retina se ve.
3. Continuar con el cepillado y el peeling de acción hasta el lado medial de la retina es casi todo lo expuesto. Evitar arañazos y golpes en la retina expuestos.
4. Para quitar el RPE lateral en la retina que se enfrenta ahora a la baja, el enfoque y el cepillo que en un ángulo de aproximadamente 45 ° de la superficie de la placa de cultivo.
5. Quitar el EPR que se adjunta relativamente firme a la ora serrata fijando la porción desprendida del EPR a la cultura placa para la disección, y luego levante suavemente la retina.
6. Rollo de la retina en la parte inferior de la placa de cultivo para limpiar el RPE residual.
   1. Nos hemos dado cuenta de que este especial de poliestireno Falcon placa de cultivo tiene una adherencia preferencial de RPE durante aproximadamente 20 minutos una vez que un embrión es aplastado. Esta propiedad se utiliza para la eliminación de los restos de RPE. Sin embargo, las células de la retina se adhieren a la superficie, en menor medida, lo que puede ser inspeccionado de cerca con una lupa de alta. Uno tiene que encontrar un equilibrio entre la integridad de la eliminación del EPR y la integridad de la retina.
   2. La lente con frecuencia se adhiere a la placa de cultivo y se separa de la retina durante el proceso de laminación. En ocasiones, es necesario separar la lente de una aguja de tungsteno grabado con una acción de remolino en la superficie de la lente.
7. Estos procedimientos pueden eliminar con éxito RPE de la retina sin comprometer la integridad de los tejidos. Esto se indica mediante una buena morfología general (Figura 1 B y B ') y la histología (Figura 1 B "), la flecha, en particular, la preservación de la matriz extracelular entre la capa de fotorreceptores y RPE es excepcional (fig. 1B."; compara con la histología de todo el embrión (Figura 1 ")).

3B parte: RPE-adjunto disección de la retina ³

1. Preparar el embrión como se describe en la Parte 2.
2. Pin de la cabeza a la placa de cultivo por las pinzas de asistente. Levantar los ojos suavemente desde la parte lateral y posterior despliegue de la cara anterior.
   1. La coroides y presunto tejido escleral en el exterior de la capa de RPE se unen relativamente bien a la piel y puede ser en su mayoría se quitó rodando los ojos con cuidado para la cara anterior.
3. Retire el objetivo con una aguja de tungsteno después de la parte lateral del ojo está expuesta y cuando el ojo está aún en la piel.
4. Estos procedimientos con éxito puede preservar la capa de RPE conjunto con la retina. Coroides presuntivo y tejido escleral puede ser retirado en gran parte (Figura 1 C, "C y C").

Parte 4: recolección de muestras de tejido para el trabajo de ARN

1. Las muestras disecadas se pueden recoger en TRIzol en un tubo de microcentrífuga de RNasa libre para abajo caracterización de ARN como se describe antes del ^1.

Resultados representante

Figura 1. (A) y lateral (A) vista dorsal de una cabeza de larvas de pez cebra a las 52 HPF antes de la disección. (A ") El apartado correspondiente histológico de la cabeza de larvas en (A) y (A '). (B) y lateral (B) vista dorsal de la retina diseccionado en 54 HPF. La superficie de la retina estaba intacto, tanto lateral y puntos de vista dorsal. (B ") En la sección correspondiente histológico de la retina disecado en (B) y (B '). La estructura de la retina y la retina de laminación estaba intacto. En particular, la matriz extracelular entre la capa de fotorreceptores y RPE (A ", las flechas) estaba bien conservado en la retina disecados (B", las flechas). (C) y lateral (C ') vista medial de la disección RPE-adjunto retina en 52 HPF. RPE capa estaba intacto y continuo, que también se indica por el corte histológico de los tejidos disecados (C "). El área blanca en C 'es el nervio óptico (flecha). Por histología, las muestras de tejido fueron recogidos y fijados en el 4% paraformaldehído. plástico inclusión y corte de estas muestras se realizaron como se describe ^3. Barra de escala = 50 micras.

Discussion

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra puede efectivamente obtener la retina intacta y las retinas de RPE-adjunto. Esto ayuda considerablemente los estudios de expresión pertenecientes a un tejido ocular específico (es decir, la retina o RPE). De hecho, hemos utilizado con éxito estos procedimientos para obtener los perfiles de expresión de ARN de toda la retina y el EPR ^{1 3.} La utilidad de estos perfiles es apoyado fuertemente por nuestra reciente identificación de las vías y las familias de genes que son perturbados en una diferenciación de la retina mutante ^2. Los pasos más importantes en los procedimientos de disección de la retina son la acción de cepillado por la punta de las pinzas y los tejidos laminados para la eliminación de los restos del EPR. Nos encontramos con poner los codos en el brazo ajustable descansa en una silla durante la disección sustancialmente a estabilizar el movimiento de las manos no deseadas. Además, algunos restos de RPE puede permanecer en la ora serrata. Esto se debe a que esta región no puede entrar en contacto con la superficie de la adhesión de la placa de cultivo para la disección. Sin embargo, la mayoría de las células del EPR se rompe durante la acción de cepillarse los dientes y pelado y estos restos RPE es poco probable que estar intacto. Además, debe existir un equilibrio alcanzado entre la integridad de la retina y la integridad de la eliminación del EPR. Para la disección de RPE-adjunto retinas, la mayor parte de la coroides y los tejidos presunto escleral que se ven como una membrana transparente y delgada, puede despegarse con la piel. También es posible eliminar estos restos por el cepillado de la superficie del tejido, sin embargo, un equilibrio también debe ser alcanzado entre la integridad del EPR y la integridad de la contaminación de la extirpación de tejido. Hemos realizado con éxito la disección de fdd 1-3 (24-72 HPF), que cubren las etapas críticas de la morfogénesis del ojo de pez cebra ^7. En promedio, se tarda unos 10 a 20 minutos de la ruptura de la cabeza a la colección de los tejidos disecados. Con la práctica, el estudiante puede realizar una buena disección y coherente dentro de un mes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cordless pestle motor	VWR international	47747-370
DC power supply	Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)	VWR international	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm	BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope	Olympus Corporation	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Wooden Applicator	Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.