Summary
Regia di hESC differenziazione in cellule specifiche, ha generato molto interesse nella medicina rigenerativa. Forniamo un conciso, passo-passo il protocollo per la determinazione della
Abstract
Cellule staminali embrionali umane (hESC) hanno una capacità illimitata di auto-rinnovamento, e la capacità di differenziarsi in cellule derivate da tutti e tre i foglietti embrionali embrionali (1). Regia di hESC differenziazione in tipi cellulari specifici ha suscitato molto interesse nel campo della medicina rigenerativa (ad esempio, (2-5)) e metodi per la determinazione della
Protocol
Il protocollo scritto che segue si basa su parametri pubblicati segnalati dagli autori, con alcune modifiche. Il protocollo è eseguita con l'approvazione del Istituzionali Animal Care UCSF e utilizzo (IACUC) e Cell Stem Oversight di ricerca (SCRO) Comitati.
Cultura I. cellule staminali embrionali umane (hESC)
- HESC crescere in standard 6-bene (3,5 cm di diametro pozzi) piatti.
- Almeno 12 ore prima passaging cellule, mouse fibroblasti semi embrionali (MEF; ottenuti da CF1 giorni e12.5 topi tempo-accoppiati, irradiato a 1000 Ci) alimentatore cellule su piastre rivestite con gelatina 1% (6,7). MEF dovrebbero essere placcato confluenza al 50-60%, o 4 x 10 5 cellule per 3,5 cm di diametro e (Figura 1).
- Celle di passaggio, quando le colonie hanno raggiunto confluenza ~ 70% (Figura 2).
- Per il passaggio, le cellule aspirare KSR terreno di coltura (6) dai pozzetti e sostituirlo con 0,5 ml di mezzo contenente Collagenasi IV KSR ad una concentrazione di 1 mg / ml.
- Incubare le piastre con collagenasi IV a 37 ° C / 5% di CO 2 per 5 minuti o finché i bordi di colonie cominciano a sollevare dal piatto.
- Rimuovere Collagenasi IV dal piatto, aggiungere 0,5 ml di KSR in ogni pozzetto, e manualmente raschiare le cellule per rimuovere completamente dalla piastra.
- Raccogliere la sospensione cellulare da ogni pozzetto, posto in un tubo da 15 ml, e consentono alle cellule di regolare dalla forza di gravità per 5 minuti.
- Eliminare il surnatante dal tubo, lasciando le cellule e medie in un volume totale di ~ 300μl.
- Utilizzando un 200 ul micro-pipetta insieme a tutto volume, con delicatezza pipetta la sospensione cellulare 5-6 volte a rompere le colonie.
- Portare la sospensione cellulare per un volume totale di 9 ml per pozzetto originale di celle usando KSR medio (cioè, se uno così è raccolto, il tubo deve contenere 9 ml). Integrare la media con fattore ricombinante umano fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) ad una concentrazione di 12,5 ng / ml.
- Dopo aver lavato i nuovi pozzi che contiene cellule MEF (vedi punto 2) con fosfato di Dulbecco soluzione salina tamponata (DPBS) per rimuovere tutti i siero, aggiungere 3 ml di sospensione cellulare in ogni pozzetto e incubare le piastre a 37 ° C / 5% di CO 2.
- Cambiamenti a medio KSR con bFGF 24 ore dopo il passaggio, e ogni 24-48 ore fino a quando le cellule sono pronte per essere diversi passaggi ancora.
II. Preparazione di hESC pellet per l'innesto
- A 24 ore prima del trapianto, aggiungere inibitore ROCK al mezzo KSR ad una concentrazione finale di 10μM per aumentare la vitalità cellulare (8). Un pozzetto di cellule a confluenza ~ 70% (5 x 10 5 cellule) creerà due palline, con due palline inserito per capsula renale.
- Per preparare pellet cellulari per l'innesto (9), incubare trattati con l'inibitore culture ROCK con collagenasi IV per 5 minuti a 37 ° C / 5% di CO 2.
- Aspirare il IV Collagenasi dal pozzo e sostituirlo con 1 DPBS ml con 10% di penicillina / streptomicina (pen / strep).
- Raschiare manualmente le colonie dalla piastra, lavare il pozzo con un ulteriore 1 DPBS ml con la penna / strep, e trasferire ciascuna aliquota 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml.
- Spin tubi microcentrifuga brevemente a 8.000 x g, aspirare il supernatante e risospendere il pellet in DPBS 500μl con la penna / strep.
- Per aiutare a legare insieme le cellule per il trapianto, aggiungere 100μl 1 mg / ml lectina Phaseolus vulgaris (PHA) in DPBS ad ogni provetta.
- Incubare le cellule / sospensione PHA a temperatura ambiente per 5 minuti, poi girare per 2 minuti a 8.000 x g. Ruotare i tubi a 180 ° all'interno del loro pozzi rotore e ruotare ancora per 2 minuti a 8.000 x g.
- Con attenzione aspirare il sopranatante lasciando intatto il pellet.
- Sloggiare i pellet cellulari dai tubi pipettando gentilmente KSR 200μl accanto al bordo del pellet fino a che non solleva lentamente.
- Una volta rimosso, trasferire immediatamente il pellet a 0.4μm inserti MILLICELL collocati in pozzi cm 3.5 di diametro contenente 3 KSR ml, e incubare per 2 ore per tutta la notte a 37 ° C / 5% di CO 2.
III. Capsula renale innesto
- Eseguire tutte le procedure animali in conformità con le linee guida istituzionali con le necessarie tecniche asettiche.
- Anestetizzare topi SCID beige (CB17.Cg-Prkdc scid LYST bg / CRL), di età compresa tra 8-12 settimane, utilizzando una combinazione di O2: 3% per via inalatoria isoflurane/0.5% e tribromoethanol intraperitoneale (Avertin; 25 mg / kg, preparati al momento). Due pellet cellulari per il mouse sarà innestata mediante le tecniche descritte (10).
- Dopo aver posizionato il mouse su una piastra elettrica per prevenire l'ipotermia, radere l'area incisione, poi disinfettare con clorexidina. Fai da 2,5 centimetri un'incisione attraverso la pelle, appena fuori del centro, ma in parallelo alla colonna vertebrale.
- Mantenere la zona umida con incisione sterile Salinposta, fare una piccola incisione attraverso il muscolo, appena sotto le costole e ~ 1 cm dalla colonna vertebrale. L'incisione dovrebbe essere appena sufficiente per tirare il rene attraverso, ma abbastanza piccolo che il rene non scivolare indietro nella cavità addominale senza forza.
- Tirare delicatamente il rene attraverso l'incisione del muscolo utilizzando una pipetta Pasteur di vetro che è stato tirato in forma di un ottuso, gancio leggermente ricurva.
- Bagnate il rene con DPBS sterile per evitare che la capsula si secchi. Questo può essere necessario ripetere tutta la procedura, in quanto la capsula è molto fragile.
- Utilizzando Dumont pinze # 5, estrarre delicatamente la capsula fino dal rene e fare una incisione 2 millimetri con le forbici a molla Vännäs.
- Con un'altra pipetta di vetro che è stato tirato in un finissimo, sonda smussata, fare una piccola tasca tra la capsula e il rene.
- Utilizzando un grande orifizio puntale posizionato su una pipetta di trasferimento monouso, prendere una sola cella di pellet da inserire MILLICELL. Assicurati di prendere il meno mezzi di comunicazione più lungo possibile, come supporti in eccesso possono interferire con il trasferimento a pellet.
- Tenendo premuto il bordo dell'incisione per creare la tasca, poggiate delicatamente il pellet accanto alla apertura e spingerlo nella tasca verso un polo del rene con la pipetta tirato.
- Ripetere la procedura con un secondo pellet. Inserire questo sotto la capsula del rene stesso, ma verso il polo opposto.
- Accuratamente posto la capsula posteriore verso il basso sulla pellet. Il pellet deve rimanere all'interno della tasca, e non sono necessari punti di sutura per chiudere la capsula.
- Spingere delicatamente il rene indietro nella cavità addominale e chiudere la parete muscolare con punti di sutura in seta 4-0 (o inferiore) con annesso reverse-taglio ago. L'incisione dovrebbe essere abbastanza piccolo che solo una sutura singola è necessario.
- Chiudere la pelle con una serie di 4-5 punti interrotta, utilizzando lo stesso materiale di sutura.
- Prima di posizionare il mouse indietro nella sua gabbia, amministrare 0,05 mg / kg di buprenorfina (11,12) e 5 mg / kg di ketoprofene (12,13) come analgesici a breve termine ea lungo termine, rispettivamente. Sostanze controllate dovrebbe essere utilizzato solo in conformità alle direttive istituzionali.
- Trasferire l'animale alla sua gabbia e permettono di recuperare da anestesia su una piastra elettrica. Questo dovrebbe prendere circa 20-30 minuti.
- Una volta che il mouse è completamente ambulatoriale, può essere restituito alla struttura stabulazione degli animali.
IV. Teratoma raccolta, fissazione e sezionamento
- A 8-12 settimane post-intervento chirurgico, ci dovrebbe essere un teratoma appena palpabile in prossimità del rene. Grande, pieno di liquido cisti si sviluppano spesso pure, a partire da 6-8 settimane. Questi possono richiedere un raccolto prima se causano disagi all'animale. Dal teratomi crescere a ritmi più lenti rispetto cisti, però, si vuole aspettare più a lungo possibile per ottenere un teratoma di dimensioni sufficienti per l'analisi (cioè, almeno 8 settimane).
- Rimuovere il rene, teratoma, e qualsiasi cisti che circonda come un blocco di tessuto dalla cavità addominale utilizzando lo stesso approccio chirurgico mediante il quale il rene è stato originariamente accessibile (cfr. Sezione III, i passaggi 1-4 sopra).
- Posizionare l'intero blocco di tessuto asportato in una provetta contenente formalina tamponata al 10%.
- Lasciare che il teratoma per fissare una notte a 4 ° C.
- Il giorno seguente, togliere il teratoma dal tubo. Sezionare via qualsiasi cisti renali e per quanto possibile, senza danneggiare il teratoma stesso (Figura 3). Grandi teratomi possono essere tagliati a metà per facilitare la dissezione e incorporamento.
- Elaborare il teratoma utilizzando uno standard di paraffina fissazione tecnica. Unità automatiche sono disponibili (ad esempio, Hypercenter Shandon):
I. Flex 80% di alcol 2 ore II. Flex 80% di alcol 1 ora III. Flex 85% di alcol 1,5 ore IV. 95% di alcol Flex 1 ora V. 100% Flex alcool 1 ora VI. 100% Flex alcool 1 ora VII. 100% Flex alcool 1 ora VIII. Clear-Rite 3 1 ora IX. Clear-Rite 3 1 ora X. Clear-Rite 3 1 ora XI. Paraffina (TissuePrep) 2 ore XII. Paraffina (TissuePrep) 2 ore
V. immunoistochimica e analisi
- Una volta inclusi in paraffina, sezione teratoma a 5 micron fette di serie con un microtomo rotativo, e le sezioni galleggiante su vetrini.
- Prima della colorazione, cuocere le diapositive per almeno un'ora.
- Macchiare le diapositive con ematossilina e eosina utilizzando metodi standard per identificare le strutture del tessuto rappresentante di ciascuno dei tre strati germinali embrionali (Figura 4):
I. Lavare Xilene 3-5 minuti II. Xilene 3-5 minuti III. 100% di alcol 3-5 minuti IV. 100% di alcol 3-5 minuti V. 95% di alcol 3-5 minuti VI. 80% di alcol 3-5 minuti VII. Acqua di lavaggio (diverse modifiche) 2 minuti VIII. Ematossilina di Gill # 3 2-5 minuti IX. Acqua di lavaggio (diverse modifiche) finché l'acqua non è pulita X. Acqua di Scott (per nuclei blu) 3 minuti o più XI. Acqua di lavaggio (diverse modifiche) 1-2 minuti XII. Eosina Y 1 minuto XIII. Acqua di lavaggio (diverse modifiche) 30 secondi XIV. 80% di alcol 1 minuto XV. 95% di alcol 2 minuti XVI. 95% di alcol 2 minuti XVII. 100% di alcol 3 minuti XVIII. 100% di alcol (pulito) 3 minuti XIX. Xilene 2 minuti o più XX. Xilene 2 minuti o più - Montare un coprioggetti su ogni diapositiva con Permount.
VI. Rappresentante Risultati
Figura 1. Placcatura di fibroblasti di topo irradiati CF1 embrionale come strato alimentatore per hESC coltura indifferenziato. MEF sono placcati in confluenza ~ 50%, come mostrato qui, o 4 x 10 5 cellule per 3,5 cm di diametro e in un 6-ben piatto cultura. Bar, 100 micron.
Figura 2. Esempio di cultura subconfluent di hESC indifferenziata su uno strato di alimentatore MEF. HESC sono coltivate su livelli alimentatore MEF fino a ~ 70% confluenti, come mostrato qui, poi diversi passaggi come descritto. Bar, 100 micron.
Figura 3. Esempio di teratomi espiantati. Seguito espianto, il teratoma, il rene, e qualsiasi tessuto accessorio sono fissati come un blocco in formalina, poi il tessuto dei reni e accessori sono mondate accuratamente via prima inclusione in paraffina.
Figura 4. Teratomi derivati da hESC indifferenziato contenere rappresentante tessuti di tutti i tre foglietti embrionali in vivo. Un teratoma, come quello illustrato nella Figura 3, è stato sezionato e colorati con ematossilina e eosina per identificare i tessuti embrionali. hESC dare origine a tessuti derivati da tutti e tre i foglietti embrionali embrionali (ectoderma (A, B), mesoderma (C), endoderma (D). (A) nascente struttura del tubo neurale. (B) epitelio squamoso primitivo. (C) Cartilagine circondato da capsula del mesenchima condensato. (D) la struttura ghiandolare intestinale. Bar, 100 micron. Le immagini riprodotte con l'autorizzazione dell'autore.
Figura 5. Analisi teratoma può essere utilizzato per mappare il destino di tag, hESC indifferenziato. Come precedentemente pubblicato (9), una miscela di hESC specificamente taggati con hESC senza tag può essere utilizzato per mappare il destino delle cellule tag in un test di formazione teratoma. Come mostrato qui, hESC indifferenziato che esprime il marcatore di superficie, CD133, e contrassegnati con maggiore proteina verde fluorescente (eGFP), sono state mescolate con untagged, hESC indifferenziato. Questi sono stati usati per formare teratomi dalla capsula renale innesto. Analisi immunoistochimica di ematossilina e eosina-macchiate sezioni teratoma con anticorpi anti-eGFP dimostra il destino neuroectodermici del hESC CD133 +. Teratomi sono stati trattati come in Figura 4 e di contrasto con anticorpi anti-eGFP (marrone) per la localizzazione dei derivati di cellule CD133 + GFP + all'interno dei tessuti. CD133 + derivate cellule (frecce) sono stati osservati nei tessuti derivanti da ectoderma embrionale, in particolare epitelio neurale (a sinistra) e la nascente tubo neurale-come le strutture (a destra). Bar, 100 micron. Le immagini riprodotte con l'autorizzazione dell'autore.
Gelatina
- 0,1% di gelatina suina
- 99,9% DPBS
- Aggiungere la gelatina alla DPBS, incubare a 37 ° C per un'ora o fino a quando tutti i gelatina va in soluzione e filtrare sterilizzare (0.22μm) prima dell'uso.
MEF media
- 10% di siero fetale bovino (qualificata)
- 90% Dulbecco Modified Medium (D-MEM)
- 1x L-Glutammina
- 1x Pen / Strep
- Filtro sterilizzare prima dell'uso.
KSR (Sostituzione Knockout siero) di medie
- 20% KnockOut sostituzione siero
- KnockOut 80% di D-MEM
- 1x L-Glutammina
- 1x Amino Acids non essenziali
- 0.1 mM β-mercaptoetanolo /
- 12,5 ng / ml bFGF
- Filtro sterilizzare.
- Conservare a 4 ° C, ma calda a 37 ° C prima di aggiungere alle cellule.
- Aggiungi bFGF immediatamente prima dell'uso.
Collagenasi IV
- Sciogliere 1 mg / ml nel terreno di KSR mettendo a 37 ° C per 1-2 ore o fino a quando tutta la polvere entra in soluzione.
- Filtro sterilizzare.
Avertin
- 0,25 g 2,2,2-tribromoethanol
- 0,25 ml di 2-metil-2-butanolo
- Incubare a 37 ° C per una notte per formare una soluzione al 100%.
- Diverse ore prima dell'intervento chirurgico, soluzione diluita al 2,5% di lavoro utilizzando DPBS e incubare a 37 ° C per almeno 1 ora.
- Filtro sterilizzare e aliquota.
- Tribromoethanol è altamente sensibile alla luce, in modo da proteggere dalla luce in tutte le fasi di preparazione e di utilizzo.
- Preparare non più di 12-24 ore prima dell'uso.
Buprenorfina
- 1 mg / ml di soluzione concentrata in metanolo
- Diluire a 0,015 mg / ml di soluzione sterile di lavoro con H 2 O.
- Conservare a -20 ° C fino a 1 mese.
Ketoprofene
- 0,5 mg / ml di soluzione di lavoro nel DPBS
- Aggiungi DPBS, incubare una notte a 37 ° C per 1-2 ore o fino a quando tutta la polvere entra in soluzione.
- Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
Discussion
Abbiamo adattato un saggio altamente efficiente per la formazione teratoma ai fini della mappatura del destino di differenziare hESC in un ambiente nel vivo. Un piccolo numero di hESC appositamente selezionato viene mescolato con indifferenziato hESC wild-type e la lectina Phaseolus vulgaris a formare un pellet di cellule. Questo si innesta sotto la capsula del rene in un mouse immunodeficienti. Il destino del hESC selezionati in origine può essere determinata mediante immunoistochimica (Figura 5), come riportato in precedenza (9). Questo metodo fornisce un prezioso strumento per l'individuazione e la generazione di tessuti specifici reagenti per la terapia cellulare.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca completa del California Institute per la medicina rigenerativa (RC1-00104), un Pubblico Servizio Sanitario Grant (HL085377) da NHLBI, e un dono da parte della Fondazione Pollin di HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
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