Summary
SELEX protocollen bestaan uit meerdere ronden van selectie, die elk vereisen regeneratie van gebonden liganden, die op hun beurt behoefte aan vaste primer sequenties aan weerszijden van de willekeurige bibliotheek regio's. Deze vaste primer sequenties kunnen interfereren met de selectieprocedure (vals positieven en negatieven). Hier presenteren wij een primer-vrij protocol.
Abstract
Aptameren zijn zeer gestructureerd oligonucleotiden (DNA of RNA) die kunnen binden aan doelstellingen met affiniteit die vergelijkbaar zijn met antilichamen 1. Ze zijn geïdentificeerd door middel van een in vitro selectie proces genaamd Systematische Evolutie van de liganden door de exponentiële verrijking (SELEX) om een breed scala aan doelen te herkennen, van kleine moleculen aan eiwitten en andere macromoleculen 2-4. Aptameren hebben eigenschappen die zeer geschikt zijn voor in vivo diagnostische en / of therapeutische toepassingen: Naast goede specificiteit en affiniteit, ze gemakkelijk worden gesynthetiseerd, strengere verwerking omstandigheden te overleven, ze zijn slecht immunogeen, en hun relatief geringe omvang kan resulteren in gemakkelijke penetratie van weefsels.
Aptameren die zijn geïdentificeerd door middel van het standaard SELEX proces omvatten doorgaans ~ 80 nucleotiden (nt), aangezien zij meestal geselecteerd uit nucleïnezuur bibliotheken met ~ 40 nt lang gerandomiseerde regio's plus het vaste primer sites van ~ 20 nt aan elke kant. De vaste primer sequenties kan dus bijna omvatten ~ 50% van de bibliotheek sequenties, en daarom kan positief of negatief compromis identificatie van aptameren in het selectieproces 3, hoewel bioinformatica methoden suggereren dat de vaste sequenties niet significant bijdragen aan de aptameer structuur na selectie 5 . Om deze potentiële problemen, zijn primer sequenties geblokkeerd door complementaire oligonucleotiden of de overstap naar verschillende sequenties halverwege tijdens de rondes van SELEX 6, of ze zijn afgesneden tot 6-9 nt 7, 8. Wen en Gray 9 ontwierp een primer-vrije genomische SELEX methode, waarbij de primer sequenties werden volledig verwijderd uit de bibliotheek voor de selectie en werden vervolgens geregenereerd om versterking van de geselecteerde genomische fragmenten mogelijk te maken. Echter, om gebruik van de techniek, een unieke genomische bibliotheek moet worden gebouwd, die beschikt over beperkte diversiteit, en regeneratie na het ronden van selectie is gebaseerd op een lineaire reamplification stap. Als alternatief zijn pogingen om problemen veroorzaakt door vaste primer sequenties met behulp van zeer efficiënte verdeling te omzeilen een ontmoeting gehad met problemen met betrekking tot PCR-amplificatie 10.
We hebben een primer-vrij (PF) selectie methode die aanzienlijk vereenvoudigd SELEX procedures en effectief elimineert primer-storingen 11, 12. De protocollen werken op een eenvoudige wijze. De centrale willekeurige gebied van de bibliotheek wordt gezuiverd, zonder overbodige flankerende sequenties en is gebonden aan een geschikt doelwit (bijvoorbeeld om een gezuiverde eiwit of complexe mengsels zoals mobiele lijnen). Dan is de gebonden sequenties worden verkregen, herenigd met flankerende sequenties, en opnieuw versterkt tot geselecteerde sub-bibliotheken te genereren. Als een voorbeeld, hier zijn we geselecteerd aptameren om S100B, een eiwit marker voor melanoom. Bindingstesten liet Kd s in de 10 -7-10 -8 M serie na een paar ronden van selectie, en we laten zien dat de aptameren effectief te functioneren in een sandwich bindend formaat.
Protocol
1. Korte beschrijving van de Primer-Free Selection Protocollen
Een double-stranded DNA-bibliotheek werd geconstrueerd met behulp van PCR met de bijbehorende oligonucleotiden (zie figuur 1 en 2, Stap a), die een centrale willekeurig domein van 30 nt bevat, geflankeerd door twee primer regio's. Twee lichtjes verschillende "primer-free" (PF)-protocollen zijn ontwikkeld. In het dsDNA bibliotheek, de 5'-regio bevat een endonuclease "knikken" site voor de endonuclease Nt.BstNBI; dit enzym erkent dsDNA, maar splitst slechts een streng van het DNA-substraat. Het 3'-gebied van de dsDNA bibliotheek bevat een ander "knikken" site, voor de endonuclease Nt.BbvCI dat ook erkent dsDNA, maar splitst slechts een streng, waardoor een CC aan het 3 'uiteinde (PF 1), evenals een BspMI endonuclease restrictie site, die beide strengen waardoor er geen extra 3 'nucleotiden (PF 2) klieft. We over het algemeen in eerste instantie gebruik van de PF een protocol (omdat het makkelijker om afzonderlijke fragmenten die tijdens het selectieproces, zie hieronder), en dan gebruik van de PF 2 protocol voor de volgende ronden van selectie.
De 32 nt van 5'-pN30-CC-3 'fragment (aangewezen 32 +-fragment) en de 30 nt van 5'-pN30-3' fragment (aangewezen 30 +-fragment) werden respectievelijk gegenereerd door Nt.BbvCI / Nt . BstNBI of BspMI / Nt.BstNBI splitsing van het dsDNA bibliotheek en de gel-zuivering. De 32 +-fragment bevat de 30 nt willekeurig domein, met een CC flankerende sequentie aan het 3'-uiteinde (PF 1). De 30 +-fragment (PF 2) bestaat uitsluitend uit het NT-30 willekeurige domein sequentie. De "self-brug" 66 - fragment (met de random N30 regio met de 5 'en 3' flankerende sequenties) werd verkregen door het gel zuivering (Nt.BbvCI of Nt.BstNBI snijdt alleen de bovenste "+" streng). Deze zelf-brug is rechtstreeks verkregen in de PF een protocol, of kunnen worden gegenereerd en geïsoleerd na het snijden de bibliotheek DNA met slechts NtBbv.CI of Nt.BstNBI voor de PF 2 protocol (Figuur 1 en 2, Stap b). De 32 + - of 32 +-fragmenten werden geïncubeerd met de gezuiverde eiwitten of de gekweekte melanoomcellen om de fragmenten binden aan de eiwitten of de cellen, en vervolgens de ongebonden fragmenten werden weggespoeld (figuur 1 en 2, Stap c). De gebonden of de geselecteerde fragmenten werden gebruikt voor een nieuwe generatie van de primer regio's.
In de hybridisatie / ligatie reactie, was de zelf-brug geproduceerd en gezuiverd op hetzelfde moment als de 32 + - en 30 +-fragment zuivering, 5'-uiteinde primer was hetzelfde als de bibliotheek bouw-en 3'-uiteinde primers werden vervangen met bijpassende primers die bevatte ook een extra Sp6 transcriptie promotor aan het 3'-uiteinde (Figuur 1 en 2, Stap d). De producten van de hybridisatie / ligatiereactie werden vervolgens gebruikt voor in vitro RNA transcriptie (Figuur 1 en 2, Stap e). Naar aanleiding van de RNA-transcriptie, werden de geligeerde DNA's (inclusief de niet-geselecteerde self-bridge DNA-fragment) verteerd door DNase I tot en met storende achtergrond sequenties te verwijderen. De reverse transcriptie (RT)-PCR data hebben aangetoond dat de primer-geregenereerde producten doelmatig zijn opnieuw geamplificeerd, die een 'ronde' van de selectie (figuur 1 en 2, Stap f). De achtergrond versterking getoond bij hoge cyclus nummers in de no-RT controle PCR kan volledig worden verwijderd door een extra DNase I spijsvertering, en is niet detecteerbaar na lagere cyclus van nummers, die routinematig we gebruiken.
Na 7 ronden van selectie werden aptameren gekenmerkt bindende eigenschappen. Kd's werden allemaal in de 10 -7 10 -8 M range (figuur 3). In bindingstesten, verschillende paren van aptameren toonden additieve bindend, waaruit blijkt dat zij verschillende sites op het eiwit S100B doel. Wij zijn dan ook paren van aptameren getest in "sandwich" bindingstesten, zowel op glas microarrays (codelink dia's) met behulp van fluorescent-tagged seconden aptameren, en op gederivatiseerd gouden nanodraden met een tweede aptameren gekoppeld aan 50 nm goud nanodeeltjes (AuNPs; figuur 3). In beide gevallen, bindende specificiteit was hoog: Op codelink microarrays, geen sandwich binding werd waargenomen met aptameren, die niet zien additief verbindend in al Kd bepalingen. Met gederivatiseerde nanodraden zagen we vrijwel geen binding aan non-target eiwitten, en de individuele sandwich complexen kan worden waargenomen via de aptameer gekoppelde AuNPs (figuur 3).
2. Materialen
2.1. Generatie van PF DNA Bibliotheek en Reamplification van Bound Fragments
Details worden beschreven in de Pan en Clawson, 2009; Pan et al., 2008..
2.2. Gezuiverde eiwit selectie op basis van
- 20 mM Tris-HCl, pH 7,4
- 32 +-Fragment en 30 +-Fragment
- Selectie buffer (2,5 mM CaCl 2, 5 mM MgCl 2 in 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4, Gibco)
- Ni-NTA Agarose Kralen (Qiagen)
- Polypropyleen kolom (Qiagen)
- Binding Buffer (50 mM Na tweeHPO 4-NaH 2 PO 4, pH7.2, 150 mM NaCl)
- Uitgedrukt, gezuiverd S100B-eiwit in Binding Buffer (5 ug / ul)
- Fenol: CHCl3: IAA (pH 7,9, Ambion)
- 3 M NaAc, pH 5,2
- 100%, en 70% ethanol
2.3. TOPO Klonen en Sequencing analyse van de geselecteerde dsDNA bibliotheken
- 7 e ronde geselecteerde PCR-producten (extra rondes kunnen worden uitgevoerd om de optimalisatie van aptameer binding verder)
- pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen)
- DH5 Component cellen (Invitrogen)
- Plasmide Mini Kit (Qiagen)
- M13 forward primer
- Informax's Vector NTI (Invitrogen)
2.4. Binding Kenmerken van de Aptameren
- Aptameren en controle oligo (N 30 CC en de N 30, IDT)
- T4 polynucleotidekinase (New England Biolabs)
- γ-32 P-ATP (3000 Ci / mmol, 10 uCi / ml)
- Gezuiverd S100B in Binding Buffer (5 ug / ul)
2.5. Sandwich bindingstesten met Gezuiverd S100B eiwit en Selected Aptameren
- De 1 ste aptameer werd gekoppeld aan ofwel a.) codelink microarray dia's of b.) Au nanodraden.
- Gezuiverde eiwit S100B, verdund tot ofwel 0,125 uM in 70 ul voor een) of een uM in 50 ul voor b).
- De 2 e aptameer ofwel was gelabeld met a.) Alexafluor 546 voor de codelink reeks dia's, of b.) gekoppeld aan 50 nm AuNPs voor de studies met gederivatiseerd Au nanodraden.
3. Methoden
3.1. Generatie van PF DNA Bibliotheek
Gedetailleerde methoden en protocollen voor aptameer selectie kan worden gevonden in Pan en Clawson, 2009; Pan et al., 2008..
3.2. Aptameer selectie met behulp van Gezuiverd eiwit S100B
Human S100 calcium bindend eiwit B (S100B. Gene ID # 6285) werd gebruikt als een doel. Het Zijn 6-gelabeld S100B-eiwit (98 aminozuren in lengte) werd tot expressie gebracht en gezuiverd met behulp van de QIAexpressionist systeem. (Qiagen). Indien gewenst of aangegeven, kan het zijn 6-tag enzymatisch worden verwijderd. Tijdens het ronden van selectie, was een pi monster van elke stap opgeslagen voor vloeistofscintillatietelling aan de algemene bindende efficiëntie te bepalen.
3.2.1. Voorbereiding van PF Bibliotheek-DNA-fragmenten
- Resuspendeer de 32 + en 30 + fragmenten in 40 ul van 20 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Verhit 3 min bij 85 ° C en afkoelen tot 37 ° C gedurende 3 minuten in een incubator van 37 ° C.
- Voeg 760 ul van de selectie buffer (2,5 mM CaCl 2, 5 mM MgCl 2 in 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4, GIBCO) en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C, vervolgens bij kamertemperatuur (RT) te houden gedurende 10 minuten.
- Passeren door een kolom die Ni-NTA-agarose korrels (QIAGEN) pre-selectie van gewassen met buffer, dan op RT te houden tot gebruik.
3.2.2. Voorbereiding van de Ni-NTA Agarose-Bead Bound S100B bij RT
- Spin down 400 pi van de Ni-NTA agarose parels voor 3 sec en gooi het supernatant.
- Was de beads met 400 pi van de binding buffer (50 mM Na 2 HPO 4-NaH 2 PO 4, pH7.2, 150 mM NaCl) door zachtjes pipetteren 5 keer, dan spin down en gooi het supernatant.
- Twee keer herhaal stap 2.
- Voeg 400 ul van gezuiverd S100B (5 ng / ul, gesuspendeerd in bindingsbuffer) en voorzichtig pipet 5 keer per 3 min. voor in totaal 15 minuten.
- Spin down Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Was de kraal-gebonden S100B met 400 ul bindingsbuffer door zachtjes pipetteren drie keer, dan spin down en gooi het supernatant.
- Tweemaal herhalen stap 6.
3.2.3. Selectie van S100B-gebonden Aptameren
- Overdracht van de 32 + - en 30 +-fragmenten uit de 3.2.1 tot en met de hiel-gebonden S100B.
- Incubeer 15 min en meng voorzichtig om de 3 min door voorzichtig pipetteren.
- Was de S100B-DNA complex met 800 ul bindingsbuffer door zachtjes pipetteren, dan spin down en gooi het supernatant.
- Twee keer herhaal stap 3.
3.2.4. Herstel van de S100B-Selected Aptameren
- Voeg 200 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), warmte 3 min bij 85 ° C, vortex een min en spin down, vervolgens over de supernatant naar een nieuwe buis.
- Herhaal stap 1 een keer, en combineren de supernates.
- Zuiveren de geselecteerde DNA-fragmenten als per stappen 9-12 uit eerdere publicaties (11, 12).
3.2.5. TOPO Klonen en Sequencing analyse voor de identificatie van Consensus aptameer Sequences
- Kloon van de 10 e ronde geselecteerde PCR-producten in pCR2.1-TOPO vector (van Invitrogen). Extraklonen kan worden gedaan verdere selecties worden uitgevoerd.
- Volgorde 40-50 enkele kolonies met M13 forward primer (we gebruiken de Moleculaire Genetica Core Facility op de Hershey Medical Center).
- Lijn de geselecteerde sequenties met behulp van Informax van de Vector NTI (Invitrogen).
- Bepaal de consensus sequenties op basis van de uitlijning.
- Consensus aptameren werden vervolgens gekocht van Integrated DNA Technologies.
3.3. Sandwich bindingstesten met paren van geselecteerde Aptameren
3.3.1. Microarray-formaat met behulp van fluorescent gelabelde 2 e aptameren.
- Consensus 1 ste Aptameren werden gesynthetiseerd met een 5'-amineC6 groep. Ze werden gesuspendeerd in drukken buffer tot een uiteindelijke concentratie van 15 uM en gevlekte op codelink Activated Slides (GE Healthcare / Amersham Biosciences) met behulp van een Apogent Ontdekkingen MicroGrid Arrayer in het DNA Microarray faciliteit PSU, University Park), na codelink aanbevolen protocollen. Elke dia werd gedrukt met 12 arrays.
- Hybridisatie werd uitgevoerd in een 2 x 8-indeling Microarray hybridisatie Cassette (Array It, TeleChem International). De Microarray Cassette werd afgedicht met behulp van nuclease-vrije lijm afdichting folie (AlumaSeal II, Research Products International) om verdamping te voorkomen.
- S100B-eiwit werd verdund in PBS om de juiste concentratie in 70 ul en toegepast op de putjes van de microarray cassette. Binding aan de aptameren afgedrukt op de codelink slide werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De putten van de cassette werden vervolgens individueel gewassen 3X met PBS + 5 mM MgCl 2 (PBSM) en een overmatige wasbuffer was weggevaagd. De fluorescent gelabelde aptameren werden verdund in PBSM tot 0,125 uM in 70 ul, en vervolgens verwarmd tot 85 ° C gedurende 3 minuten, gevolgd door 3 minuten op ijs. Aptameren werden toegepast op de putjes van de microarray cassette, en gedurende een uur bij kamertemperatuur. Wells werden weer individueel gewassen 3x met PBSM. De cassette werd toen uit elkaar gehaald, ad het objectglaasje werd gespoeld in PBSM. De dia werd vervolgens grondig gedroogd door middel van centrifugeren, en gescand met behulp van een Scanning Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer).
3.3.2. Gederivatiseerde Nanodraad formaat met behulp van 2 e aptameren gekoppeld aan 50 nm AuNPs
Goud nws (~ 5 uM in lengte, 320 nm in diameter) werden gesynthetiseerd door galvanostatic elektrodepositie in poreuze aluminiumoxide membranen volgende, eerder gepubliceerde protocollen (13, 14). Bij ontbinding van het poreuze membraan, werden de nanodraden geresuspendeerd in 1 ml ethanol.
Zoals opgemerkt, werd DNA gekocht van Integrated DNA Technologies. Goud nanodeeltjes (50 nm) werden gekocht bij Ted Pella. Gethioleerde DNA werd gesplitst met 100 mM DTT in 0,1 M natriumfosfaat pH 8,3 gedurende een uur en daarna gezuiverd in een Centri-spin 10 kolom.
Aptameer gehechtheid aan Gold NWS en NP's
Een 50 pi aliquot van Au nanodraden werd geplaatst in een 0,5 ml non-stick centrifugebuis en gespoeld in 10 mM fosfaatbuffer, 300 mM NaCl, pH 7,4. DNA gethioleerde aan het 5 'uiteinde (met een 10 T spacer op 5' einde) werd toegevoegd bij een uiteindelijke concentratie van 0,4 uM om de draden. Het monster werd gevortexed gedurende 30 minuten en vervolgens gespoeld door middel van centrifugeren (8100 g) drie keer met de 10 mM fosfaatbuffer, 300 mM NaCl, pH 7,4 en drie keer met 50 mM fosfaatbuffer, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. De DNA-gecoate draden werden geresuspendeerd in 100 ul buffer te verdunnen met de helft.
DNA-gederivatiseerde AuNPs werden bereid door toevoeging van 50 pi 100 mM 2 e aptameer (met een spacer van 10 T's op het 5'-uiteinde) tot 1 ml 50 nm AuNPs en verwarmd bij 37 ° C gedurende een uur. Na de verwarming, was 10 mM natriumfosfaat buffer, 1 M NaCl, pH 7,4 toegevoegd (25 uL twee keer, gevolgd door 100 ul, 150 pL, en 128 pi) van 0,5 uur. De conjugaten werden achtergelaten op een 37 ° C verwarmen 's nachts te blokkeren voor gebruik. Monsters werden gespoeld 3 keer met 50 mM fosfaatbuffer, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. Conjugaten werden geresuspendeerd in 120 ul buffer.
Sandwich hybridisatie op nws
DNA-gecoate draad, verdund 1 ui, werden toegevoegd aan de buffer in PCR-buizen. S100B eiwit of HtrA1 controle eiwit (1 ug / pi) werd toegevoegd voor een uiteindelijke concentratie van 1 uM in 50 ul buffer (~ 10-12 eiwitmoleculen toegevoegd per vierkante nanometer van Au nanodraadje oppervlak). Monsters werden vortex voor ~ 2 uur. Draden werden gespoeld door centrifugeren (8100 g) drie keer met 50 mM fosfaatbuffer, 5 mM MgCl 2, pH 7,2 en werden elk opnieuw gesuspendeerd in 20 pL AUNP / DNA-conjugaten. De draden waren gevortexed in de conjugaten voor 2 uur, en daarna werden gespoeld 5x door centrifugeren (1300 g) met 50 mM fosfaatbuffer, 5 mM MgCl 2, pH 7,2 om het teveel aan nanodeeltjes te verwijderen. De monsters werden opnieuw gesuspendeerd in20 pi buffer en gedroogd op Au gecoate Si wafers voor de FE-SEM-analyse.
FE-SEM beelden van de nanodraden werden verkregen met behulp van een Leeuw 1530 Field Emission Scanning Electron Microscope met behulp van een Schottky veld-emissie elektronen bron in een 5,00 kV bedrijfsspanning.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1. De 5'-Primer-Free (PF 1) en Primer-Free (PF 2) protocollen.
(A) De PF een DNA-aptameer selectie protocol. De bibliotheek oligonucleotiden worden samen gegloeid, en onderworpen aan PCR-amplificatie met een double-stranded DNA-bibliotheek rendement (a). Het 5'-uiteinde primer-vrij (PF 1) random regio in de PF enkelstrengs DNA-bibliotheken is voorbereid door Nt.BstNBI / Nt.BbvCI vertering (knipplaatsen zijn gemarkeerd met rode pijlpunten) en de gel-reinigingen, en het zelf -brug (zwarte pijl) wordt geïsoleerd door gel zuivering (b). Na selectie (c), worden de geselecteerde sequenties (aangeduid pS30-CC) gehybridiseerd met hun overeenkomstige oligomeren en de zelf-brug en geligeerd aan re-genereren van de eerder verwijderde primer regio's. In dit stadium zijn primers geïntroduceerd die bevatten een Sp6 promotor aan het 3'-uiteinde (d). Dit wordt vervolgens gebruikt om RNA met de geselecteerde regio's (e) transcriberen. Ten slotte is de RNA wordt dan uitsluitend opnieuw versterkt (de template-DNA is verteerd) met behulp van RT-PCR (f), en de geselecteerde sub-bibliotheek is klaar voor de volgende ronde van de selectie.
(B) De PF twee DNA-aptameer selectie protocol. De bibliotheek oligonucleotiden worden gegloeid bij elkaar en onderworpen aan PCR-amplificatie met een double-stranded DNA-bibliotheek rendement (a). De primer-vrij (PF 2) random regio in de PF enkelstrengs DNA-bibliotheek wordt bereid door Nt.BstNBI / BspMI vertering (cut sites zijn aangeduid met pijlpunten) en gel zuivering. De self-brug is ofwel geïsoleerd van de PF een protocol en / of door een enkele-vergisting van de start bibliotheek met Nt.BstNBI (b), in combinatie met gel zuivering. Na selectie (c), worden de geselecteerde sequenties (aangewezen pS30) gehybridiseerd met hun overeenkomstige oligomeren en de zelf-brug, en geligeerd aan de eerder verwijderde primer regio's te regenereren. Net als in PF 1, zijn primers geïntroduceerd die bevatten een Sp6 promotor aan 3'-uiteinde (d). Dit wordt vervolgens gebruikt om RNA met de geselecteerde regio's (e) transcriberen. Het RNA wordt dan uitsluitend opnieuw geamplificeerd met behulp van RT-PCR (f), en de geselecteerde sub-bibliotheek is klaar voor de volgende ronde van de selectie.
Figuur 2. Schematische voorstelling en experimentele resultaten / reductie tot de praktijk van de PF selectie protocol. Aangewezen stappen komen overeen met die afgebeeld in figuur 1. Na het verteren van de PF bibliotheek gebouwd door PCR (Stap a) met restrictie-endonucleasen (zoals aangegeven), werden de verteerd producten gescheiden door PAGE op een 10% gel onder denaturerende omstandigheden. De bijbehorende fragmenten verkregen met de PF een en PF 2 selectie-protocollen worden weergegeven (stap b). Na selectie (Stap c), zijn de gebonden aptameren gehybridiseerd met hun overeenkomstige oligomeren en de zelf-brug, en geligeerd aan de eerder verwijderde primer regio's te regenereren. Aan 3'-uiteinde, zijn primers geïntroduceerd die bevatten een Sp6 promotor aan 3'-uiteinde (Stap d). 32 P-gelabelde RNA's werden getranscribeerd met behulp van geligateerd producten van 1, 0,5, 0,25, 0,125 ul van 5 ul reacties, en waren gescheiden door PAGE op 6% gels onder denaturerende omstandigheden (Stap e). De transcripties werden vervolgens behandeld met DNase te verwijderen van de niet-geselecteerde willekeurige DNA-regio's, reverse getranscribeerd in cDNA, en daarna opnieuw geamplificeerd voor 7, 14, 21 of 28 PCR-cycli. De producten werden gescheiden door PAGE op 8% gels onder niet-denaturerende omstandigheden. De 66 nt fragment vertegenwoordigt de volledige lengte product met de geselecteerde pS30-CC en pS30 sequenties als re-ingebed in de 5 'en 3' flankerende sequenties. Migratie van PhiX174/HinfI markers wordt getoond aan de linkerkant (stap f). Controles onder weglating van de reverse transcriptie (RT) stap. Een kleine hoeveelheid van het product in deze monsters kan worden gezien bij hoge cyclus nummers, deze waarschijnlijk volledig geëlimineerd kunnen worden met een tweede (of verlengde) DNase spijsvertering stap.
Figuur 3. Binding Kenmerken van geselecteerde Aptameren en hun Gepaard Gebruik in een Sandwich-indeling.
A. concentratie-afhankelijke 32 P-aptameer bindende bepaling voor Kd. Aptameren zijn 5'-uiteinde gelabeld met behulp van g-32 P-ATP (3000Ci/mmol, ~ 10 mCi) en T4 polynucleotidekinase (New England Biolabs), en bindende was bepaald zoals beschreven.
B. 5'-amine-gederivatiseerde 1 ste aptameren werden gekoppeld aan microarrays codelink. Gezuiverd S100B-eiwit gebonden was aan de 1 ste aptameer, werden de dia's grondig gespoeld en AlexaFluor546-gelabelde 2 e aptameer was gebonden aan de 1 ste aptameer: S100B complexen. Na het spoelen door, werd fluorescentie gekwantificeerd met behulp van een ScanArray scanner.
C. 5'-thiol gederivatiseerde 1 ste aptameren werden gekoppeld aan Au nanodraden met behulp van standaard thiol chemie. 2 e aptameren werden gekoppeld aan 50 nm AuNPs op dezelfde manier. Gezuiverde eiwit S100B (links) of gezuiverd HtrA1 controle eiwit (rechts) werd vervolgens als eerste de gederivatiseerde nanodraden gebonden. Na een grondige spoelen, 2 e aptameer-50 nm AuNPs werden vervolgens gebonden aan de 1 ste-aptameer-nanodraad: S100B complexen. Na het spoelen door, gebonden sandwich complexen werden gevisualiseerd met behulp van veld-emissie scanning elektronenmicroscopie. Schaal bars = 1 micrometer.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Craig Paul op de Core Microarray faciliteit voor zijn hulp. Dit werk werd ondersteund door NIH / NCI subsidie # CA118591 van de IMAT Program. SLD erkent ook een Pennsylvania Space Grant Consortium Fellowship voor financiële steun. Deze publicatie werd ook gesteund door de Pennsylvania State University Materials Research Institute Nano Fabrication Network en de National Science Foundation Cooperative arbeidsovereenkomst nr. 0335765, National Nanotechnology Infrastructure Network, met Cornell University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | |||
| HotMaster TAQ DNA Polymerase | 5 PRIME | ||
| dNTP Mix | Sigma-Aldrich | ||
| Acrylamide | Fisher Scientific | ||
| UltraPure 10X TBE Buffer | Invitrogen | ||
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | ||
| TEMED | Fisher Scientific | ||
| PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker | Promega Corp. | ||
| Ethidium Bromide | |||
| α-32P-dCTP | |||
| Phenol:ChCl3:IAA | Ambion | ||
| NaCl | |||
| Ethanol | |||
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | ||
| Urea | Fisher Scientific | ||
| Photographic Film | ECE Scientific | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| CaCl2 | GIBCO, by Life Technologies | ||
| MgCl2 | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | ||
| Polypropylene Column | Qiagen | ||
| NaHPO4 | |||
| NaAc | |||
| Detroit-551 cells | |||
| SK-MEL-31 cells | |||
| MEM | |||
| TrypLE Express | GIBCO, by Life Technologies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Promega Corp. | ||
| Sp6 RNA Polymerase | Promega Corp. | ||
| RNase-Free DNase I | Promega Corp. | ||
| RNase Inhibitor | Promega Corp. | ||
| SensiScript Reverse Transcriptase | Qiagen | ||
| pCR-2.1-TOPO Vector | Invitrogen | ||
| DH5α Compotent Cells | Invitrogen | ||
| Plasmid Mini Kit | Qiagen | ||
| Vector NTI | Invitrogen | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | ||
| γ-32P-ATP |
References
- Kulbachinskiy, A. V. Methods for selection of aptamers to protein targets. Biochemistry (Moscow). 72, 1505-1518 (2006).
- Mairal, T. Aptamers: molecular tools for analytical applications. Anal Bioanal Chem. 390, 989-1007 (2008).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX -- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolec Engineering. 24, 381-403 (2007).
- Que-Gewirth, N. S., Sullenger, B. A. Gene therapy progress and prospects: RNA aptamers. Gene Ther. 14, 283-2891 (2007).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. J Mol Evol. 67, 95-102 (2008).
- Shtatland, T., Gill, S. C., Javornik, B. E. Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX. Nucleic Acids Res. 28, E93-E93 (2000).
- Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection. Nucleic Acids Res. 34, E86-E86 (2006).
- Vater, A., Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX. Nucleic Acids Res. 31, E130-E130 (2003).
- Wen, J. D., Gray, D. M. Selection of genomic sequences that bind tightly to Ff gene 5 protein: primer-free genomic SELEX. Nucleic Acids Res. 32, E182-E182 (2004).
- Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: addressing the polymerase chain reaction issue. Anal Chim Acta. 564, 91-916 (2006).
- Pan, W. H., Clawson, G. A. Primer-free aptamer selection using a random DNA library. Methods Mol Biol. , Forthcoming (2009).
- Pan, W., Xin, P., Clawson, G. A. Minimal-Primer and Primer-Free SELEX Protocols for Selection of Aptamers from Random DNA Libraries. BioTechniques. 44, 351-360 (2008).
- Nicewarner-Pena, S., Freeman, G., Reiss, B.
- JC, H. ulteen, CR, M. artin A general template-based method for the preparation of nanomaterials. J Materials Chem. 7, 1075-1087 (1997).
