Primer-Free aptamer Val användning av ett slumpmässigt DNA-bibliotek

Summary

SELEX protokoll omfattar flera omgångar av urval, var och en som kräver förnyelse av bundna ligander, vilket i sin tur kräver fasta primer sekvenser flankerar slumpmässiga biblioteket regionerna. Dessa fasta primer sekvenser kan störa urvalsprocessen (falskt positiva och negativa). Här presenterar vi en primer-fri protokollet.

Abstract

Aptamers är mycket strukturerade oligonukleotider (DNA eller RNA) som kan binda till mål med tillhörighet jämförbar med antikroppar ^1. De identifieras med hjälp av ett in vitro-selektion process som kallas Systematisk Utveckling av ligander av Exponential anrikning (SELEX) att känna igen en mängd olika mål, från små molekyler till proteiner och andra makromolekyler ^2-4. Aptamers har egenskaper som är väl lämpade för in vivo diagnostik och / eller terapeutiska tillämpningar: Förutom god specificitet och affinitet, är de lätt syntetiseras, överleva strängare behandling villkor, de är dåligt immunogena, och deras relativt ringa storlek kan resultera i facile penetration av vävnader.

Aptamers som identifieras genom de vanliga SELEX processen omfattar vanligtvis ~ 80 nukleotider (NT), eftersom de är oftast väljs från nukleinsyra bibliotek med ~ 40 nt lång randomiserad regioner plus fasta platser grundfärg på ~ 20 nt på varje sida. Den fasta primer sekvenser kan därför bestå av nästan ~ 50% av biblioteket sekvenser, och kan därför positivt eller negativt kompromiss identifiering av aptamers i urvalsprocessen ^3, även om bioinformatik tillvägagångssätt tyder på att den fasta sekvenser inte bidrar avsevärt till aptamer struktur efter val ⁵ . För att hantera dessa potentiella problem har primer sekvenser spärrats av kompletterande oligonukleotider eller bytte till olika sekvenser mitt under omgångarna av SELEX ^6, eller de har trimmat till 6-9 nt ^{7, 8.} Wen och Gray ⁹ konstruerade en primer utan genomisk SELEX metod, där primern sekvenser var helt bort från biblioteket innan valet och därefter regenereras att förstärkningen av den valda genomiska fragment. Men att använda tekniken, har en unik genomisk bibliotek att byggas, som har en begränsad mångfald och förnyelse efter rundor av urvalet bygger på en linjär reamplification steg. Alternativt, är insatser för att kringgå problem som orsakas av fasta primer sekvenser med hög effektivitet partitionering träffade problem med PCR-amplifiering ^10.

Vi har utvecklat en primer-fria (PF) urvalsmetod som väsentligt förenklar SELEX rutiner och effektivt eliminerar primer-störningsproblem ^{11, 12.} De protokoll som arbetar på ett enkelt sätt. Den centrala slumpmässiga regionen biblioteket renas utan ovidkommande flankerande sekvenser och är bunden till ett lämpligt mål (till exempel till ett renat protein eller komplexa blandningar såsom cell-linjer). Då bundna sekvenser erhålls, återförenas med flankerande sekvenser, och åter förstärks för att generera utvalda sub-bibliotek. Som ett exempel, här vi valt aptamers till S100B, ett protein som markör för melanom. Bindande analyserna visade Kd s på 10 ^-7 - 10 ^-8 m räckvidd efter några rundor av urval, och vi visar att aptamers fungera effektivt i en smörgås bindande format.

Protocol

1. Kort beskrivning av Primer-Free Val Protokoll

En dubbel-strängat DNA-biblioteket skapades med hjälp av PCR med motsvarande oligonukleotider (figur 1 och 2, steg ett), som innehåller en central slumpmässig domän 30 nt, flankeras av två primer regioner. Två lite annorlunda "primer-free" (PF) protokoll utvecklades. I dsDNA biblioteket innehåller 5'-regionen en endonuclease "nicking" webbplats för endonuclease Nt.BstNBI, detta enzym erkänner dsDNA utan klyver bara en del av DNA-substrat. I 3'-regionen i dsDNA bibliotek innehåller en annan "nicking" plats, för endonuclease Nt.BbvCI som också erkänner dsDNA utan klyver bara en del, vilket ger en CC på 3'end (PF _1), samt en BspMI endonuclease begränsning webbplats, som klyver båda delarna lämnar inga ytterligare 3 "nukleotider (PF _2). Vi använder i allmänhet PF _{1 Protokoll} från början (eftersom det är lättare att separera fragment som produceras under urvalsprocessen, se nedan), och sedan anställa PF ₂ protokollet för senare rundor av urval.

Den 32 nt av 5'-pN30-CC-3-fragment (utsedda 32 +-fragment) och 30 nt av 5'-pN30-3-fragment (utsedda 30 +-fragment) var respektive genereras av Nt.BbvCI / NT . BstNBI eller BspMI / Nt.BstNBI klyvning av dsDNA biblioteket, och gel-rening. Den 32 +-fragment innehåller 30 nt slumpmässiga domän, med ett cert flankerande sekvens vid 3'-änden (PF _1). Den 30 +-fragment (PF ₂₎ består endast 30 nt slumpmässig domän sekvens. Den "self-bro" 66 - fragment (som innehåller slumpmässiga N30 regionen med 5 "och 3" flankerande sekvenser) erhölls genom gel rening (Nt.BbvCI eller Nt.BstNBI skär bara den övre "+" sträng). Detta self-bron erhålls direkt i PF _{1-protokollet,} eller kan genereras och isolerade efter kapning biblioteket DNA med enbart NtBbv.CI eller Nt.BstNBI för PF ₂ protokoll (Figur 1 och 2, steg B). Den 32 + - eller 32 +-fragment inkuberades med renade proteiner eller de odlade cellerna melanom att låta fragment binder till proteiner eller celler, och sedan den obundna fragmenten spolades bort (Figur 1 och 2, steg c). De bundna eller valda fragment användes för ny generation av primer regionerna.

I hybridisering / ligation reaktion var själv-bron produceras och renas samtidigt som de 32 + - och 30 +-fragment rening, 5'-änden primer var samma som biblioteket bygg-och 3'-änden primers ersattes med matchande primers som även innehöll en extra SP6 transkription promotor vid 3'-änden (figur 1 och 2, steg d). De produkter av hybridisering / ligation reaktionen användes sedan för in vitro-RNA transkription (figur 1 och 2, steg e). Efter RNA transkription var knyts ihop DNA (inklusive omarkerade egen brygga DNA-fragment) rötning av DNas jag att ta bort störande bakgrund sekvenser. I omvänd transkription (RT)-PCR-data har visat att primer-regenererade produkter effektivt var reamplified, som utgör en "omgång" av val (Figur 1 och 2, steg f). Bakgrunden förstärkningen visas i hög cykel nummer i no-RT kontroll PCR helt kan avlägsnas med ytterligare DNas jag matsmältningen, och är inte detekterbara efter lägre cykel nummer, som vi rutinmässigt använder.

Efter 7 omgångar av urval, var aptamers kännetecknades för bindning egenskaper. Kd-talet var alla i 10 ^-7 10 ^-8 m räckvidd (Figur 3). I bindande analyser visade olika par aptamers tillsats bindande, vilket tyder på att de riktar distinkta webbplatser på S100B proteinet. Vi testade därför par aptamers i "sandwich" bindande provmetoder, både på glas microarrays (Codelink diabilder) med fluorescerande-märkta second aptamers, och på derivatiserade guld nanotrådar med andra aptamers kopplat till 50 nanopartiklar nm guld (AuNPs, Figur 3). I båda fallen var bindande specificiteten hög: På Codelink mikroarrayer, ingen smörgås bindande observerats med aptamers som inte har visat additiva bindande i Kd bestämningar. Med derivatiserade nanotrådar vi observerade nästan ingen bindning till icke-målproteiner och enskilda smörgås komplex kan observeras via aptamer-kopplad AuNPs (Figur 3).

2. Material

2,1. Generering av PF DNA Bibliotek och Reamplification av bundet Fragments

Detaljer finns beskrivna i Pan och Clawson, 2009, Pan et al, 2008..

2,2. Renat protein Baserat Selection

1. 20 mM Tris-HCl, pH 7,4
2. 32 +-Fragment och 30 +-Fragment
3. Val Buffer (2,5 mm CaCl _2, buffrat 5 mM MgCl ₂ i 1X Fosfat saltlösning, pH 7,4, Gibco)
4. Ni-NTA agaros Pärlor (Qiagen)
5. Polypropylen Kolumn (Qiagen)
6. Bindande buffert (50 mM Na ₂HPO _{4-Nah 2} PO _4, pH7.2, 150 mM NaCl)
7. Uttryckt, renat S100B protein i Binding Buffer (5 mikrogram / l)
8. Fenol: CHCl3: IAA (pH 7,9, Ambion)
9. 3 M NaAc, pH 5,2
10. 100% och 70% etanol

2,3. Friluftskartan Kloning och sekvensering av utvalda dsDNA bibliotek

1. ^{7: e} omgången utvalda PCR-produkter (ytterligare omgångar kan utföras för att fortsätta optimering av aptamer bindande)
2. pCR2.1-TOPO Vector (Invitrogen)
3. DH5 Component Cells (Invitrogen)
4. Plasmid Mini Kit (Qiagen)
5. M13 framåt primer
6. Informax s Vector NTI (Invitrogen)

2,4. Bindande Egenskaper hos aptamers

1. Aptamers och kontroll oligos (N ₃₀ CC och N _30, IDT)
2. T4 polynucleotide Kinase (New England Biolabs)
3. ^γ-32 P-ATP (3000 Ci / mmol, 10 μCi / ml)
4. Renat S100B i bindande buffert (5 mikrogram / l)

2,5. Sandwich Bindande analyser med renat S100B protein och Selected aptamers

1. Den ¹ aptamer var kopplad till antingen a) Codelink microarray diabilder eller b.) Au nanotrådar.
2. Renat S100B protein, utspädda till antingen 0,125 nm i 70 l för a) eller 1 nm i 50 l för B).
3. Den 2: ^a aptamer antingen var märkt med A.) Alexafluor 546 för Codelink mängd bilder, eller b.) kopplat till 50 nm AuNPs för studier med derivatiserade Au nanotrådar.

3. Metoder

3,1. Generering av PF DNA-bibliotek

Detaljerade metoder och protokoll för aptamer urval finns i Pan och Clawson, 2009, Pan et al, 2008..

3,2. Aptamer Urval med hjälp av renad S100B Protein

Mänskliga S100 kalcium bindande protein B (S100B. Gen ID # 6285) användes som mål. Den Hans _6-märkta S100B protein (98 aminosyror lång) uttrycktes och renas med hjälp av QIAexpressionist systemet. (QIAGEN). Om så önskas eller angivna, kan hans _6-taggen tas bort enzymatiskt. Under omgångarna av valet blev en mikroliter prov från varje steg sparas för LSC att fastställa den totala bindande effektivitet.

3.2.1. Beredning av PF Bibliotek-DNA-fragment

1. Återuppslamma 32 ⁺ och 30 fragment ⁺ i 40 mikroliter av 20 mM Tris-HCl, pH 7,4.
2. Heat 3 min vid 85 ° C och kyla ned till 37 ° C i 3 min i en kuvös på 37 ° C.
3. Tillsätt 760 mikroliter av urval buffert (2,5 mm CaCl _2, buffrat 5 mM MgCl ₂ i 1X Fosfatbuffrad saltlösning, 7,4 pH, GIBCO) och inkubera i 3 min vid 37 ° C, sedan hålla i rumstemperatur (RT) i 10 min.
4. Passera genom en kolonn som Ni-NTA agarose-pärlor (QIAGEN) förtvättad med urval buffert, sedan hålla på RT tills det ska användas.

3.2.2. Beredning av Ni-NTA agaros-Bead Bound S100B vid RT

1. Spinn ner 400 mikroliter av Ni-NTA agaros pärlor i 3 sek och kassera supernatanten.
2. Tvätta pärlor med 400 mikroliter av bindande buffert (50 mM Na ₂ HPO _{4-Nah 2} PO _4, pH7.2, 150 mM NaCl) genom att försiktigt pipettera 5 gånger, sedan spinn ner och kassera supernatanten.
3. Upprepa steg 2 två gånger.
4. Tillsätt 400 mikroliter av renat S100B (5 mikrogram / mikroliter, upphängd i bindande buffert) och försiktigt pipettera 5 gånger 3 min för totalt 15 min.
5. Spinn ner och kassera supernatanten.
6. Tvätta pärla bundna S100B med 400 mikroliter av bindande buffert genom att försiktigt pipettera 3 gånger, sedan spinn ner och kassera supernatanten.
7. Upprepa steg 6 två gånger.

3.2.3. Val av S100B bundna aptamers

1. Överför 32 + - och 30 +-fragment från 3.2.1 till pärlan-bundna S100B.
2. Inkubera i 15 minuter och blanda försiktigt var 3 minuter genom att försiktigt pipettera.
3. Tvätta S100B-DNA-komplex med 800 mikroliter av bindande buffert genom att försiktigt pipettera, då spinn ner och kassera supernatanten.
4. Upprepa steg 3 två gånger.

3.2.4. Återvinning av S100B-Selected aptamers

1. Tillsätt 200 mikroliter 20 mM Tris-HCl (pH7.4), värme 3 min vid 85 ° C, virvel 1 min och spinn ner, överför sedan supernatanten till ett nytt rör.
2. Upprepa steg 1 en gång, och kombinera supernates.
3. Rena utvalda DNA-fragment per steg 9-12 från tidigare publikationer (11, 12).

3.2.5. Friluftskartan Kloning och sekvensering analys för identifiering av sekvenser samförståndet aptamer

1. Klon den ^{10: e} omgången utvalda PCR-produkter i pCR2.1-TOPO vektor (från Invitrogen). Ytterligarekloning kan göras som ytterligare val utförs.
2. Sekvens 40-50 enstaka kolonier med M13 framåt grundfärg (använder vi molekylär genetik Core Facility vid Hershey Medical Center).
3. Rikta den valda sekvenser med hjälp Informax s Vector NTI (Invitrogen).
4. Bestäm konsensus sekvenser bygger på anpassningar.
5. Konsensus aptamers har sedan köpts av Integrated DNA Technologies.

3,3. Sandwich Bindande försök med Par av Selected aptamers

3.3.1. Microarray format med hjälp av märkta fluorescerande 2: ^a aptamers.

1. Konsensus 1 ^st aptamers var syntetiseras med en 5'-amineC6 fraktionen. De var upphängd i utskrift buffert till en slutlig koncentration av 15 mikroM och fläckig på Codelink Aktivt diabilder (GE Healthcare / Amersham Biosciences) med hjälp av en Apogent Upptäckter MicroGrid Arrayer i DNA microarray anläggningen PSU, University Park), efter Codelink rekommenderade protokoll. Varje bild är tryckt med 12 matriser.
2. Hybridisering utfördes i en 2 x 8-format Microarray Hybridisering Kassett (Array Det, TeleChem International). Den Microarray Kassett förseglades med nukleasfritt folie självhäftande tätning (AlumaSeal II, forskning Products International) för att förhindra avdunstning.
3. S100B protein som spätts i PBS till lämplig koncentration i 70 l och tillämpas på brunnarna i microarray kassetten. Bindning till aptamers tryckt på Codelink bilden var i 1 timme i rumstemperatur. Brunnarna i kassetten då var individuellt tvättas 3X med PBS + 5 mm MgCl ₂ (PBSM), höga tvättbuffert var utplånat. Den fluorescerande aptamers var utspädd i PBSM till 0,125 mikrometer i 70 l, och sedan värms till 85 ° C i 3 minuter följt av 3 minuter på is. Aptamers tillämpades på brunnarna i microarray kassett, och inkuberas i en timme vid rumstemperatur. Wells åter individuellt tvättade 3X med PBSM. Kassetten var då tas isär, ad hela bilden sköljdes i PBSM. Bilden var då helt torr genom centrifugering, och skannas med en Scanning Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer).

3.3.2. Derivatiserade Nanowire format med hjälp av 2: ^a aptamers kopplad till 50 nm AuNPs

Guld NWS (~ 5 mikrometer i längd, 320 nm i diameter) var syntetiseras av galvanostatiska ED inom porösa aluminium membran efter tidigare publicerade protokoll (13, 14). Efter upplösningen av den porösa membranet var nanotrådar återsuspenderade i 1 ml etanol.

Som nämnts var DNA köpts av Integrated DNA Technologies. Guld nanopartiklar (50 nm) köptes från Ted Pella. Thiolated DNA klyvs med 100 mm DTT på 0,1 M natriumfosfat pH 8,3 i en timme och sedan renas i ett Centri-spin 10 kolumn.

Aptamer bilaga till Guld NWS och NPS

En 50 mikroliter delprov av Au nanotrådar placerades i en 0,5 ml non-stick centrifugrör och sköljas i 10 mM fosfatbuffert, 300 mM NaCl, pH 7,4. DNA thiolated i 5 'änden (med en 10 T spacer vid 5' slut) lades till en slutlig koncentration av 0,4 mikroM till ledningarna. Provet var vortexed i 30 min och sedan sköljas genom centrifugering (8100 g) tre gånger med 10 mM fosfatbuffert, 300 mM NaCl, pH 7,4 och tre gånger med 50 mM fosfatbuffert, 5 mm MgCl _2, pH 7,2. DNA-belagda ledningar suspenderade i 100 mikroliter buffert för att späda ut med hälften.

DNA-derivatiserade AuNPs var förberedda genom tillsats av 50 l 100 mm ^{2: a} aptamer (med en spacer på 10 T: s vid 5'-änden) till 1 ml 50 nm AuNPs och uppvärmda vid 37 ° C i en timme. Efter uppvärmning, var 10 mM natriumfosfat buffert, 1M NaCl, pH 7,4 läggas (25 mikroliter två gånger, följt av 100 mikroliter, 150 mikroliter, och 128 mikroliter) med 0,5 timmars mellanrum. Den konjugat var kvar på ett 37 ° C värmeblock natten före användning. Proverna sköljs tre gånger med 50 mM fosfatbuffert, 5 mm MgCl _2, pH 7,2. Konjugat var suspenderade i 120 mikroliter buffert.

Sandwich Hybridisering på NWS

DNA-belagda ledningar, 1 mikroliter utspädning lades till buffert i PCR-rör. S100B protein eller HtrA1 kontroll protein (1 mikrogram / l) har lagts till en slutlig koncentration av 1 mikrometer i 50 mikroliter buffert (~ 10-12 proteinmolekyler tillsättas per kvadrat nanometer över Au nanotrådar yta). Proverna vortexed för ~ 2 timmar. Ledningar sköljas genom centrifugering (8100 g) tre gånger med 50 mM fosfatbuffert, 5 mm MgCl _2, pH 7,2 och var varje nytt slammas upp i 20 mikroliter AuNP / DNA-konjugat. Ledningarna var vortexed i konjugat för 2 tim, och sedan var sköljas 5x genom centrifugering (1300 g) med 50 mM fosfatbuffert, 5 mm MgCl _2, pH 7,2 för att ta bort överskottet nanopartiklar. Proverna var suspenderade i20 mikroliter buffert och torkade om Au belagda Si wafers för FE-SEM analys.

FE-SEM bilder av nanotrådar erhölls med hjälp av ett Lejon 1530 fältemission svepelektronmikroskop med en Schottky fält-utsläpp elektron källa på en 5,00 kV driftspänning.

4. Representativa resultat

Figur 1. Den 5'-Primer-Free (PF ₁₎ och Primer-Free (PF ₂₎ protokoll.

(A) PF ₁ DNA-aptamer urval protokollet. Biblioteket oligonukleotider glödgas tillsammans, och utsätts för PCR-amplifiering att ge ett dubbelsträngat DNA-bibliotek (A). Den 5'-änden primer-fria (PF ₁₎ slumpmässiga region från PF enda DNA bibliotek är utarbetad av Nt.BstNBI / Nt.BbvCI digestions (klyvning platser är markerade med röda pilspetsar) och gel-reningar, och jaget -brygga (svart pil) är isolerat med gel rening (B). Efter val (c), är den valda sekvenser (utsedda pS30-CC) hybridiseras med motsvarande oligomerer och själv-bron och knyts ihop på nytt skapa den tidigare borttagna primer regioner. I detta skede är primers introduceras som innehåller en SP6 promotor vid 3'-änden (D). Detta används sedan för att transkribera RNA som innehåller utvalda regioner (e). Slutligen är RNA sedan uteslutande nytt Amplified (mallen DNA bryts ned) med hjälp av RT-PCR (f), och den valda sub-biblioteket är redo för nästa omgång av valet.

(B) PF ₂ DNA-aptamer urval protokollet. Biblioteket oligonukleotider glödgas samman och utsätts för PCR-amplifiering att ge ett dubbelsträngat DNA-bibliotek (A). Grundfärgen-fria (PF ₂₎ slumpmässiga region från PF enda DNA-biblioteket är utarbetad av Nt.BstNBI / BspMI digestions (klipp platser är markerade med pilar) och gel rening. Den själv-bron är isolerad antingen från PF _ett protokoll och / eller genom en enda-nedbrytning av utgångspunkterna bibliotek med Nt.BstNBI (b), i kombination med gel rening. Efter val (c), är den valda sekvenser (utsedda pS30) hybridiseras med motsvarande oligomerer och själv-bron, och knyts ihop för att återskapa den tidigare borttagna primer regioner. Som i PF _1, primers introduceras som innehåller en SP6 promotor vid 3'-änden (D). Detta används sedan för att transkribera RNA som innehåller utvalda regioner (e). RNA är då uteslutande reamplified med RT-PCR (f), och den valda sub-biblioteket är redo för nästa omgång av valet.

Figur 2. Schematisk representation och experimentella resultat / minskning till praxis PF valet protokollet. Speciellt stegen motsvarar de visas i Figur 1. Efter rötningen av PF biblioteket konstruerades av PCR (steg ett) med restriktionsendonukleaser (som anges), var de uppdelade produkter åtskilda av sidan på en 10% gel i denaturering villkor. Motsvarande fragment som erhålls med PF ₁ och PF ₂ protokoll urval visas (steg B). Efter val (Steg c), är bundna aptamers hybridiseras med motsvarande oligomerer och egenföretagare bron, och knyts ihop för att regenerera den tidigare borttagna primer regioner. I 3'-änden, är primers introduceras som innehåller en SP6 promotor vid 3'-änden (steg D). Transkriberades med hjälp knyts ihop produkter på 1, 0,5, 0,25, 0,125 l från 5 l reaktioner ³² av P-märkt RNA, och var åtskilda av SIDA på 6% geler i denaturering villkor (steg e). Utskrifterna därefter behandlades med DNas att bort omarkerade slumpmässiga DNA-regioner, omvänd transkriberas till cDNA och sedan reamplified för 7, 14, 21 eller 28 PCR-cykler. Produkter separat för sida på 8% geler under icke-denaturering villkor. Den 66 nt fragment representerar full längd som innehåller det valda pS30-CC och pS30 sekvenser som åter är förankrade i den 5 'och 3' flankerande sekvenser. Migration av PhiX174/HinfI markörer visas till vänster (steg f). Kontroller ingår utelämnande av omvänd transkription (RT) steg. En liten mängd produkt på ett sådant prov kunde ses i hög cykel nummer, vilket antagligen kan helt elimineras med en andra (eller långvarig) DNas matsmältningen steg.

Figur 3. Bindande Egenskaper hos utvalda aptamers och deras Kopplade Används på Sandwich-format.
A. koncentrationsberoende ³² P-aptamer bindande för Kd Fastställande. Aptamers var 5'-änden märkt med ^g-32 P-ATP (3000Ci/mmol, ~ 10 mCi) och T4 polynucleotide Kinase (New England Biolabs), och bindande was bestäms enligt anvisningarna.

B. 5'-amin-derivatiserade 1 ^st aptamers var kopplat till Codelink microarrays. Renat S100B protein bundet till den ¹ aptamer var bilderna sköljas noggrant och AlexaFluor546-märkt 2: ^a aptamer var bunden till den ¹ aptamer: S100B komplex. Efter genom sköljning, var Fluorescens kvantifieras med hjälp av en ScanArray skanner.

C. 5'-tiol derivatiserade 1 ^st aptamers var kopplat till Au nanotrådar med standard tiol kemi. 2: ^a aptamers var kopplat till 50 nm AuNPs på samma sätt. Renad S100B protein (vänster) eller renat HtrA1 kontroll protein (till höger) var då bunden först till derivatiserade nanotrådar. Efter noggrann sköljning, 2: ^a aptamer-50 nm AuNPs därefter bundet till 1: ^{a-aptamer-nanotrådar:} S100B komplex. Efter genom sköljning, var bundna smörgås komplex visualiseras med fält-utsläpp svepelektronmikroskop. Skala staplar = 1 mm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl
HotMaster TAQ DNA Polymerase	5 PRIME
dNTP Mix	Sigma-Aldrich
Acrylamide	Fisher Scientific
UltraPure 10X TBE Buffer	Invitrogen
Ammonium Persulfate	Bio-Rad
TEMED	Fisher Scientific
PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker	Promega Corp.
Ethidium Bromide
α-32P-dCTP
Phenol:ChCl3:IAA	Ambion
NaCl
Ethanol
Restriction Enzymes	New England Biolabs
Urea	Fisher Scientific
Photographic Film	ECE Scientific
PBS	GIBCO, by Life Technologies
CaCl2	GIBCO, by Life Technologies
MgCl2	GIBCO, by Life Technologies
Ni-NTA Agarose Beads	Qiagen
Polypropylene Column	Qiagen
NaHPO4
NaAc
Detroit-551 cells
SK-MEL-31 cells
MEM
TrypLE Express	GIBCO, by Life Technologies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs
Dimethyl Sulfoxide	Promega Corp.
Sp6 RNA Polymerase	Promega Corp.
RNase-Free DNase I	Promega Corp.
RNase Inhibitor	Promega Corp.
SensiScript Reverse Transcriptase	Qiagen
pCR-2.1-TOPO Vector	Invitrogen
DH5α Compotent Cells	Invitrogen
Plasmid Mini Kit	Qiagen
Vector NTI	Invitrogen
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs
γ-32P-ATP