מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

Summary

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

Abstract

השירות של מולקולה אחת הגישות פלואורסצנציה מיקרוסקופ הוכח להיות הצלחה גדולה בהבנת תגובות ביולוגיות בעשור האחרון. החקירה של אינטראקציות מולקולריות עם רזולוציות של זמן ומרחב גבוהה עמוק בתוך התאים נותר מאתגר בשל אותות חלשים מטבעם הנובעים מולקולות בודדות. עובד לאחרונה על ידי יאנג et al. הראו כי צר שדה מיקרוסקופיה epifluorescence מאפשר הדמיה של תחבורה nucleocytoplasmic ברמת מולקולה בודדת. לפי הגישה מולקולה בודדת, קינטיקה חשובים, כגון זמן תחבורה יעילות גרעיני, על מולקולות מטען אות תלויים ובלתי תלויים הושגו. כאן אנו תיאר פרוטוקול הגישה המתודולוגית עם רזולוציה spatiotemporal משופרת של 0.4 ms ו -12 ננומטר. ברזולוציה משופרת אפשרה לנו ללכוד תחבורה פעילה חולף ואירועים דיפוזיה סבילה דרך מתחמי נקבוביות הגרעין (NPC) למחצה תאים שלמים. אנו מצפים כי בשיטה זו כדי לשמש הבהרת אירועים מחייב סחר אחרות בתוך התאים.

Protocol

1. הכנת מערכת התא לצורך הניסוי מולקולה בודדת

1. לפחות שבוע מראש, להתחיל תרבות חדשה של קו תא הלה מן המלאי על ידי הפשרת ב 37 ° C ו לשים בקבוקון 25 ² ס"מ תרבות עם 5 מ"ל התקשורת, דגירה התאים ב 37 מעלות בתוך 5% CO ₂ החממה למשך 24 שעות ו לפצל אותו לפחות 3 פעמים על מנת לספק תנאי אופטימלי עבור התאים. עם זאת התאים לא אמור להיות מפוצל יותר מ 20 פעמים בשל נטייה של קצב הצמיחה שלהם להאט באופן משמעותי. תאים הלה היו בעבר מהונדסים גנטית יש GFP (חלבון הפלואורסצנט הירוק) התמזגו חלבון קרום הגרעין נקבוביות המעטפה פום 121. זה הכרחי עבור לוקליזציה מדויק של המעטפה גרעיני.
2. יום אחד לפני הניסוי, התאים המיועדים בניסוי מולקולה בודדת צריך להתפשט על פליטת לכסות autoclaved להציב בצלחת פטרי סטרילית. Coverslip צריך להיות מושעה DMEM (מדיום שונה Dulbecco של הנשר, גרנד איילנד, ניו יורק) בתוספת 4.5 g / L גלוקוז, 862 מ"ג / ליטר GlutaMAX-I, 15 מ"ג / מ"ל ​​פנול אדום, 100 U / mL פניצילין, 100μg/mL סטרפטומיצין ו -10% נסיוב עגל בן יומו. נפח של תרבות צריכה להיות 1mL לכל להחליק לכסות, מפוזרים באופן אחיד על פני כל השטח. מאכלים אלה פטרי עם תלושי לכסות אז ממוקמות לתוך CO ₂ באינקובטור והמשיך למשך 24 שעות לפני הניסוי. על מנת תרבות התא מתאים בניסוי מולקולה בודדת התא confluency על להחליק את המכסה לא יעלה על 70% לספק חופש טוב מאגרים לשטוף וחלבונים עניין עוברת התחבורה גרעיני.
3. ביום הניסוי, זרימה לתאי נבנו על ידי הוספת המכסה העליון להחליק יחד עם שתי שורות של גריז סיליקון כמו מפרידי. זה חיוני כדי לוודא שהתאים לא יתייבשו במהלך תקופת ההכנה. בדרך כלל אנחנו מעדיפים שני חדרי עשה על העטיפה מעידה אחת כדי לאפשר שני תנאים שונים עבור הניסוי. מכסה מחליק שבבי קטן של זכוכית לכסות להחליק לחתוך עם סכין יהלום להיות כ 6mm2 הוצבו במהופך על Kimwipe. שתי שורות של גריז סיליקון דק לאורך הושמו הוא הקצוות של תלושי לכסות עם מזרק 10 מ"ל פלסטיק היה קצה פיפטה מחוברת באופן הדוק עם Parafilm לשלוט על גודל של גריז חרוז.
4. השקופית הלה תא מצופה היה אז בטפטוף יבשים רכוב עם שומן כמו דבק במסגרת בית במכונה אלומיניום - רוח, אשר שימש להחזיק את שקופית בעל מדגם מיקרוסקופ.
5. מחליק את המכסה העליון עם שני קווים של שומן נבחרו אז עם פינצטה הצביע ואז הפוך על שקופית התא מצופה, ויצרו תא הזרימה. התקשרות חברת יחסית נעשתה על ידי לחיצה בעדינות על הקצוות משומנת של coverslip.
6. מאז עשינו שני חדרים נפרדים בשקופית התא מצופה אחד זה חיוני כדי לספק איטום טוב כדי למנוע זיהום צולבות. לצורך זה כמה שורות של שומן סיליקון יושמו בין לתאי מהחלק העליון לחלק התחתון של השקופית כדי לאטום את בנפרד. כמה שורות של גריז הועלו גם על הצדדים החיצוניים של החדרים.
7. DMEM התקשורת נוספה לאחר מכן לחדר כדי למנוע זרימת התאים מפני התייבשות. תזרים פתרון קודמה על ידי נייר פיסה קטנה לסנן לספוג את הנוזל מזווית יציאה של בתאי לזרום. בידיים יציבות הפתרון ניתן להוסיף בו זמנית על ידי micropipette בצד אחד של החדר זרימה ביד אחת, וספגו בצד השני של נייר הסינון.
8. לאחר הבנייה, בתחתית המגלשה נשטף עם ספוגית כותנה הרטובות שקצהו, פעמיים עם מים ולאחר מכן פעמיים עם 100% אתנול.
9. לאחר השקופית הוא רכוב על המיקרוסקופ, התאים נשטף עם חוצץ 2 X 25 יבוא μL (20 Hepes מ"מ, 110 מ"מ KOAc, 5 מ"מ NaOAc, 2 מ"מ MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3). התאים permeabilized ואז ~ 2 דקות עם 2 X 25 digitonin μL מיקרוגרם / מ"ל ​​40 במאגר יבוא שטף שוב עם חוצץ 2 X 25 יבוא μL (20 HEPES מ"מ, 110 מ"מ KOAc, 5 מ"מ NaOAc, 2 מ"מ MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) בתוספת polyvinylpyrrolidone 1.5% (PVP; kDa 360). זה עשוי להיות נחוץ כדי לפקח על permeabilization בזמן אמת באמצעות שדה בהיר. PVP נכלל כל תמיסות בופר לייבא לאחר digitonin כדי למנוע נפיחות האוסמוטי של גרעינים. גרעין שלם, יחד עם cytoplasmic בסביבה מבוקרת, מספק מערכת תחבורה פשוטה מאוד המאפשר לנו להבהיר את הצעד מסובך תחבורה גרעיני אחר צעד. אנסמבל קודמות יחיד מולקולה ניסויים שנערכו במערכת סיפקו תובנות גדול בתחבורה גרעינית.

2. הכנה של חלבונים חיוניים לצורך הניסוי הגרעיני התחבורה

1. באמצעות שינוי זני חיידקים קונבנציונאלי המיוחד של E.coli (JM109) הונדסו כדי overexpress את הגנים האחראיםהייצור של החלבונים הנ"ל עניין מוחזקים המניות ב -80 ° C. (לקבלת-NLS 2xGFP השתמשנו pTrcHisB וקטור ידי Invitrogen). Loopful או ~ 50 μL של מניות קפוא של חלבון פלואורסצנטי או מטען לבטא בתאי E. coli מועברים 5 מ"ל של LB התקשורת עם תוספת של 5μL של אמפיצילין (U 1000) גדל aerobically עם רעד לילה בשעה 37 ° C ב 225 סל"ד.
2. לאחר 24 שעות 500 μL של התרבות רווי מועבר לתוך 500 מ"ל של LB התקשורת ומזועזע ב 37 ° C חממה 5-6 שעות לאחר תוספת של 250 μL IPTG (איזופרופיל _-D-1-thiogalactopyranoside) ו מודגרות עוד 5-6 שעות. זה הכרחי כי IPTG הוא מטבוליט לקטוז שמפעיל שעתוק של operon החלבי, שבו הגן lacZ מוחלף הגן של עניין IPTG משמש אז כדי לעורר ביטוי גנים.
3. תרבות הוא הסתובב אז 12,000 סל"ד במשך 15 דקות בצנטריפוגה במהירות גבוהה קירור supernatant נמחקת. תאים הם resuspended אז 40 מ"ל של CelLytic B (CelLytic התוצאות ב 'מיצוי מהיר ויעיל של חלבונים המתאימים טיהור זיקה וניתוח.) נפח צריך להיות מבוסס על 10 מ"ל לגרם 1 של גלולה. 28 μl של mercaptoethanol מתווסף לשבירת קשרים דיסולפיד ו 400 μl של פלואוריד phenylmethanesulphonyl לנטרל פרוטאזות מ לעכל חלבונים עניין לאחר תמוגה התא. "קוקטייל פרוטאז" הוא הוסיף גם (400 μL של 0.2 μL 400 מ"ג / מ"ל ​​pepstatin א של 0.2 מ"ג / מ"ל ​​leupeptin: 400 μL של 2 מ"ג / מ"ל ​​מעכבי טריפסין) על מנת להבטיח כי תמציות חלבון לא לבזות לפני ניתוח עבור מטרות של עניין. לאחר מכן, אנו מוסיפים 400 μL 1M imidazole, משמש elute החלבונים המתויגים חייב יונים ניקל מחוברת אל פני השטח של חרוזים בעמודת כרומטוגרפיה ו 1mm של DNase אני, נהג להשפיל דנ"א יחיד ו פעמיים תקועים רצויים לתוך phosphodinucleotide 5 ו oligonucleotide שברים.
4. מערבבים את התערובת הכהה על קרח במשך 30 דקות כדי לאפשר זמן מספיק לצורך התגובה, ספין ב 10000 סל"ד במשך 60 דקות בצנטריפוגה הקירור. קציר supernatant ולקראת כרומטוגרפיה לבצע את העירוי עם Ni-נ.ת. ע (ניקל nitrilotriacetic Superflow חומצה על ידי Qiagen) על ידי מסתובב צינורות צנטריפוגה microfuge במהירות מקסימלית במשך 3 דקות כביסה עם חיץ תמוגה, חוזרת ספינינג כביסה עד לקבלת תערובת ברורה של כל גוון כחול. מערבבים את תערובת כתוצאה לאט במיכל כהה על קרח למשך 60 דקות.
5. בצע את כרומטוגרפיה בעמודה זורם דרך 12 שברים כדלקמן. חלק הראשון הוא לזרום דרך של supernatant 10 מ"ל מעורבבים עם Ni-נ.ת. ע בשלב הקודם. השנייה היא 10 מ"ל של חיץ תמוגה (50 mM Na-פוספט, 300 mM NaCl, 20 מ"מ imidazole, pH 8.0), 10 מ"ל third של המאגר (10 mM imidazole, 100 mM NaCl, pH 8.0), הרביעי והיתר 0.5 מ"ל של חיץ elution (250 mM imidazole, 100 mM NaCl, pH 8.0)
6. הכן את ג'ל SDS-PAGE polyacrylamide ולהכין דגימות שלנו על ידי ערבוב של 4 μL חלק 1 ו μL של SB 5X (טריס 300mm 6.8, BME 25%, 10% SDS, גליצרול 50%). לקבלת תקן השתמשנו 100 kb הסולם הדנ"א על ​​ידי Invitrogen. לפני טעינת הרתחנו דגימות שלנו במשך 5 דקות. לאחר טעינת רצנו את הג'ל על 120V למשך 60 דקות. אז אנחנו מוכתמים, destained מיובשים ולבסוף מיבש ג'ל מיוחד 2 שעות 80C.
7. אנו נצפה אז את התוצאות על הג'ל נמצא את השברים כי הניב את התוצאה הטובה ביותר. בהתאם לחלבון של עניין שלנו, להקות צריך להיות ממוקם בהתאמה לגודל של חלבון. חלק זה צריך להיות נבחר לטיהור חלבון נוסף עם MonoQ ו Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. הריכוז מבוצע על ידי מסובב את השברים מרוכז ביותר Nanosep מסנן עם גודל נקבוביות של 10K ב 14 סל"ד במשך 5 דקות, לשטוף אותו עם חיץ elution בכל פעם. זה הכרחי כדי לקבוע את ריכוז החלבון הסופי ניצול assay BSA הליך חלבון נוסף תיוג.
9. פלואורסצנטי ירוק מהותי של NLS-2xGFP לא יכול להיות מנוצל עבור הדמיה מולקולה בודדת התחבורה גרעיני בשל צילום יציבות העניים שלה ספקטרום חפפו עם autofluorescence התא. לפיכך, אנו התווית מולקולות מטען עם עודף של ציסטאין-reactive אורגני לצבוע (Alexa555 או אלקסה 647 maleimide מתוך בדיקות מולקולריות) למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר פוספט נתרן 50 מ"מ, 150 מ"מ NaCl לאחר הפחתת עם TCEP טריס (2 - carboxyethyl) במשך 20 דקות. התגובות היו הרווה עם mercaptoethanol-2, ואת הפתרונות חלבון היו dialyzed להסיר את צבען חינם.

3. מולקולה בודדת מיקרוסקופיה

1. להגדיר את המיקרוסקופ שלנו כולל אולימפוס IX81 מצויד יעד 1.4 NA הנפט טבילה 100x (UPLSAPO 100XO, אולימפוס), 35 mW 633 ננומטר הוא Ne-לייזר (Melles המכשף), מנורת כספית עם GFP לסנן להגדיר, על שבב כפל לקבל תשלום מצמידים את המצלמה במכשיר (אשד 128 +, רופר מדעי) ואת הדואר Slidebook חבילת תוכנה (Intelligent חידושים Imaging) לרכישת הנתונים ועיבודם. המסוק אופטי (Newport) שימש ליצור מצב ב-off של עירור הלייזר. GFP ו Alexa647 הקרינה היה נרגש על ידי מנורה כספית לייזר 633 ננומטר, בהתאמה. פליטת הקרינה ירוק ואדום נאסף על ידי אותה מטרה, מסונן על ידי פילטר dichroic (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) ו מסנן פליטה (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) ו הדמיה באמצעות מצלמת CCD זהים.
2. בניסויים מולקולה בודדת, אנו מאפשרים את הזמן photobleaching הקרינה של המולקולה מטען אחד להיות יותר זמן ההובלה. כדי לקבוע את זמן photobleaching, 0.1 מטען מולקולות ננומטר על העטיפה מצופה זכוכית להחליק ולהיות תנועה אחרי 30 דקות בשל אי - ספיגה מסוימת. לאחר מכן, במהלך הזמן של הקרינה נמדדת. בהתאם החלבון פעמים photobleach הריבית יהיו שונים המבוססים על מספר cysteins מסוגל להגיב עם maleimides, ולכן עוצמת הארה אזור תאורה צריך להיות מותאם על מנת שלא לגרום photobleaching ראשוני להבטיח כי מולקולות מטען שכותרתו עם תצוגה 647 Alexa הקרינה יותר מ מטענים אינטראקציה עם NPCs.
3. עבור ניסויים בתאים permeabilized יבוא, המטען ואת cofactors תחבורה חיוני נוספו ביחד. תגובות אופייניות מטען יבוא הכיל 1 mM GTP, 0.5 מיקרומטר Importin-, 0.5 מיקרומטר Importin-1, 2 מיקרומטר רן 1 מיקרומטר NTF2 להובלת הקל ו 0.1 nM של 10KDa dextran להובלת פסיבי .. ריכוזי המטען פלורסנט היו> 100 ננומטר ניסויים בתפזורת, ו ~ 100 PM עבור מבחני מולקולה בודדת. בריכוזים אלה,> 99% של המטען היה צפוי ליצירת קומפלקסים עם Importin ו Importin. שיעור התחבורה היה פיקוח על ידי epifluorescence (אם רק היו חשובים שיעורי יחסית) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal (אם היו שיעורי מוחלטת הרצוי).
4. ראשית המיקום של המעטפה הגרעין נקבע על ידי מיקרוסקופית שדה רחב epifluorescence ידי העוסקים כספית HBO מנורה עם סט של פילטרים GFP כדי לצלם תמונה של NE. עוצמות פיקסל בתוך שורה או עמודה כ בניצב NE היו בכושר עם גאוס. עמדות השיא של גאוס עבור מערכת מסוימת של עוצמות פיקסל נחשב את המיקום NE עבור שורה ועמודה. העמדות שיא בסדרה של Gaussians כאלה היו אז בקנה אחד עם פולינום מדרגה שנייה, מניב את הנתיב של NE בתוך התמונה כולה.
5. לאחר NE הוא מקומי, חשוב להיפטר autofluorescence כל ניצול הוא 633 nm-Ne לייזר עד שהוא photobleached לחלוטין, בדרך כלל מעל 60 שניות מספיקה.
6. לדוגמה מולקולות אמור להיות כל הזמן בפתרון 1.5% PVP תערובת הוסיף לחדר זרימה בנפח של L 25, גרר מכן דרך תא החלת פתילה נייר הסינון. טיפול מוחלט צריך לקחת על תוספת של חלבונים מטעני יבוא אל התאים permeabilized מיד לאחר לוקליזציה מעטפת הגרעין מאז המוקד יכול להשתבש בקלות על ידי כל תנועה נמרצת.
7. ברגע מולקולות המטען מתווספים, 633 ננומטר הוא Ne-לייזר ששימש כדי להאיר את מסלולי התחבורה של מולקולות transiting. המסוק אופטי (Newport) צריך להיות מעורב בכל הרץ כ 5 להימנע בשל photobleaching צפיפות הספק גבוה של הלייזר, כמו גם כדי לאפשר חלק חדש של אי - photobleached מולקולות בודדות הגישה NE. סדרה של קטעי וידאו של טרנסלוקציות מולקולה בודדת יש לקחת עם מצלמת CCD מהירות גבוהה שיכולה ללכת עד Hz 2500.

4. נציג תוצאות

בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו לאסוף סדרה של קטעי וידאו הוכחת את טרנסלוקציה של מולקולות אינטראקציה עם מטען יחיד מורכבת הנקבובית גרעיני permeabilized הלה פום 121 תאים. (איור 1). יצאנו התמונה לעקוב אחר הצעדים תחבורה חולף של מולקולות dextran דרך NPC ב-digitonin permeabilized תאים הלה ביציבות להביע GFP-POM121. התאים הודגרו עם ריכוזים נמוכים של מולקולות שכותרתו dextran. קו המשווה של גרעין הוכנס להתמקד עם תמונה ברורה של הטבעת הירוקה של ה-GFP הקרינה נרגש על ידי אור כספית 488 ננומטר המנורה. חשיפה ארוכת זמן של ה-GFP-NE מאפשרת לנו להשיג מצוין אות לרעש (SNR) יחס למקם את המטוס באמצע של NE. לפני 10 kDa מולקולות dextran נמצאו מפוזר דרך NE בתוך כ 2 ms עם רזולוציה מרחבית של ננומטרים על 20-40 בשיעור גילוי מסגרת של 500 הרץ או 1000. החלטה כזו spatiotemporal מאפשרת ללכוד של רק 1-2 שלבים דיפוזיה של מולקולות dextran דרך NPC אשר אינו מספיק כדי להבהיר מידע מרחבי יותר דיפוזיה סבילה. כדי ללכוד צעדים קנס יותר של מולקולות בתוך dextran NPC עם spati טוב יותררזולוציה otemporal, יש לנו נערכו שני שיפורים משמעותיים: (i) להסתגל למסגרת מהר זיהוי שיעור הרץ 2500 כדי ללכוד צעדים דיפוזיה קנס נוסף, (ii) להעסיק צפיפות הארה גבוהה אופטי לרגש פוטונים יותר מולקולות בודדות כדי להשיג ברזולוציה מרחבית גבוהה. שיפורים אלה מאפשרים לנו לתפוס שלבים מרובים של דיפוזיה חולף של alexa647 שכותרתו מולקולות dextran ברחבי NE על ידי אור 633 ננומטר לייזר irradiance של 100 קילוואט / ² ס"מ עם רזולוציה spatiotemporal של 12 ננומטר ו -400 אלפיות השנייה.

כפי שניתן לראות בתרשים 1, סדרה של תמונות סטילס של אירועים התחבורה טיפוסי של מולקולות dextran נרשמו. על ידי מעקב אחר מסלולי המרחבי של מולקולות בודדות transiting dextran, השלבים קנס של דיפוזיה דרך NE היו מכובדים. מצאנו כי ישנם כ -30% אירועים אינטראקציה עם NE הכירו מקוריים תאים היעד. ביניהם, מולקולות dextran נע בציטופלסמה של NE יש שני יעדים: סוף בגרעין אחרי לשדר דרך NE או להעביר חזרה הציטופלסמה לאחר אינטראקציה עם NE מצבים דומים התרחשו אירועים הייצוא: dextran מולקולות החל בגרעין הזן את הציטופלסמה או מפוזר בחזרה לגרעין לאחר אינטראקציה עם NE. סדרה כזו תמונה מכילים מידע על המיקום המרחבי של מולקולות בודדות לגבי ה NPC, כמו גם מידע על זמני זמן להתעכב של מולקולות דרך NPC. על ידי ניתוח מסלולים של מולקולות dextran מסביב לאזור של NE, תדר הזמן התחבורה, יעילות הכניסה ניתן לקבוע. השעה התחבורה בעבודתנו ניתן לזהות כמו לייבא או לייצא את הזמן. הם הוגדרו הממוצע להתעכב זמן של מולקולות dextran בתוך NPCs כי לעבור לייבא או לייצא. ייבוא ​​או ייצוא יעילות הוגדר כאחוז לייבא את שלמה או את האירועים יצוא מעל סכום של האירועים המלא הנפל. תדירות לייבא או לייצא הכניסה מתייחס את מספר מולקולות אינטראקציה עם NE במהלך שנייה.

באיור 1. מסגרות וידאו נבחרים של אירועים התחבורה טיפוסי של מולקולות dextran דרך NE. (א) אירוע הציטופלסמה אל הגרעין. מולקולה בודדת dextran (נקודה אדומה) החל מ הציטופלסמה, תיקשר עם NE (קו ירוק פיקסל), והסתיימה בגרעין. מסלולים של האירוע (קווים כחולים ונקודות פתוח) היו נחושים גבי עם NE (קו שחור). הקווים ירוק ואדום מייצגים 100 ננומטר למרחקים מן NE על הציטופלסמה לבין הצד גרעיני. C, הציטופלסמה. N, את הגרעין. בר סולם: 2 מ"מ. (ב) במקרה הציטופלסמה אל הציטופלסמה. (ג) אירוע גרעין אל הגרעין. (ד) אירוע הגרעין אל הציטופלסמה.

Discussion

יש להקפיד על מנת להבטיח colocalization התקין של מולקולות NE חד במהלך הניסוי. חשוב גם לתת יחס אות לרעש גבוה, במיוחד כאשר האות הוא נמוך בשל תיוג עניים או photobleaching. דיוק לוקליזציה היא מוגבלת על ידי רעש רקע (הנובעים out-of-להתמקד הקרינה, רעש CCD readout, גורמים אחרים הנוכחי כהה).