Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

Summary

Microscopia única molécula approch forneceu introspecções romance em transporte nuclear.

Abstract

O utilitário de uma única molécula de abordagens microscopia de fluorescência tem sido provado ser de grande proveito na compreensão reações biológicas ao longo da última década. A investigação das interações moleculares com alta resolução temporal e espacial de profundidade no interior das células se manteve desafiadora devido aos sinais fracos demais decorrentes de moléculas individuais. Trabalhos recentes por Yang et al. demonstrado que a microscopia de campo estreito de epifluorescência, permite a visualização de transporte nucleocytoplasmic ao nível única molécula. Pela abordagem única molécula, cinética importantes, tais como tempo de transporte nuclear e eficiência, para as moléculas de carga de sinal-dependentes e independentes foram obtidos. Aqui nós descrevemos um protocolo para a abordagem metodológica com uma melhor resolução espaço-temporal de 0,4 nm e 12 ms. A resolução melhorada nos permitiu capturar transporte ativo transitória e eventos de difusão passiva através dos complexos poro nuclear (NPC) em semi-intactas as células. Esperamos que este método a ser utilizado na elucidação de outros eventos de ligação e do tráfico de dentro das células.

Protocol

1. Preparação do sistema de célula para a experiência única molécula

1. Pelo menos uma semana de antecedência, começar uma cultura fresca de linhagem de células HeLa de um estoque de descongelamento a 37 ° C e colocar em uma garrafa de cultura 25 cm ^2, com 5 mL de mídia, Incubar as células a 37 ° C dentro de 5% CO ₂ incubadora por 24 horas e dividi-lo pelo menos 3 vezes a fim de proporcionar uma melhor condição para as células. No entanto as células não deve ser dividido mais de 20 vezes devido à tendência de sua taxa de crescimento a abrandar de forma significativa. Células HeLa foram previamente geneticamente modificados para ter GFP (proteína fluorescente verde) fundida ao nuclear proteína de membrana envelope poros POM 121. É necessário para uma localização precisa do envelope nuclear.
2. Um dia antes do experimento, células destinados a uma experiência única molécula deve ser espalhado sobre uma lamínula autoclavado colocado em uma placa de Petri estéril. A lamela deve ser suspenso em DMEM (meio modificado Dulbecco Águia, Grand Island, NY) suplementado com 4,5 g / L de glicose, 862 mg / L Glutamax-I, 15 vermelho mg / mL de fenol, a 100 U / mL de penicilina, 100μg/mL estreptomicina e 10% soro de vitelo recém-nascido. O volume de uma cultura deve ser 1mL por lamínula, uniformemente distribuídos em toda a superfície. Estas placas de Petri com o lamínulas, em seguida, são colocados na incubadora _de CO ₂ e mantido por 24 horas antes do experimento. Para que uma cultura de células para ser adequado para uma experiência única molécula na célula confluência da lamínula não deve ultrapassar 70% para fornecer uma liberdade boa para buffers de lavagem e proteínas de interesse submetidos ao transporte nuclear.
3. No dia do experimento, o fluxo de câmaras foram construídas pela adição de uma tampa superior deslizamento juntamente com duas linhas de graxa de silicone como espaçadores. É essencial para se certificar de que as células não sequem durante a preparação. Nós geralmente preferem ter duas câmaras feitas em uma tampa de deslizamento para permitir que duas condições diferentes para o experimento. A tampa superior desliza pequenas lascas de deslizamento tampa de vidro cortado com uma faca de diamante de aproximadamente 6mm2 foram colocados de cabeça para baixo em um Kimwipe. Duas linhas de graxa de silicone foram colocados ao longo finamente ele bordas das lamínulas com uma seringa de plástico de 10 mL que tinha uma ponta de pipeta firmemente unido com Parafilm para controlar o tamanho da massa do grânulo.
4. O slide de células HeLa foi então revestido por gotejamento-dried e montado com graxa como a colagem em uma moldura de alumínio usinado em casa - temperamento, que serviu para segurar o slide no porta-amostras do microscópio.
5. Os deslizamentos tampa superior com as duas linhas de graxa foram, então, pegou com uma pinça e depois apontou invertida sobre a lâmina de células-revestido, formando uma câmara de fluxo. Um anexo relativamente firme foi feita pressionando delicadamente sobre as bordas da lamínula untada.
6. Desde que fez duas câmaras separadas em uma lâmina de células-revestido é essencial para proporcionar uma boa vedação para evitar a contaminação cruzada. Para este efeito, várias linhas de graxa de silicone foram aplicados em entre as câmaras a partir do topo para o fundo do slide para selar o intervalo. Várias linhas de graxa também foram colocados no lado externo das câmaras.
7. DMEM mídia foi então adicionada à câmara de fluxo para evitar que as células de secar. Fluxo de solução foi promovido por um pequeno pedaço de papel de filtro para absorver o líquido para fora do lado da saída das câmaras de fluxo. Com mãos firmes, a solução poderia ser acrescentado simultaneamente por micropipeta para o lado do fluxo de câmara com uma mão, e absorvida do outro lado por papel de filtro.
8. Após a construção, na parte inferior da lâmina foi lavada com um cotonete molhado com ponta de algodão, duas vezes com água, e depois duas vezes com etanol 100%.
9. Uma vez que a lâmina é montada sobre o microscópio, as células lavadas com tampão 2 X 25 mL de importação (20 Hepes mM, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3). As células permeabilizadas, em seguida, por aproximadamente 2 minutos, com 2 X 25 mL 40 digitonina mcg / mL em tampão importação e lavados novamente com 2 X 25 mL tampão importação (20 HEPES mM, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) suplementado com 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP; kDa 360). Pode ser necessário controlar a permeabilização em tempo real, usando o campo brilhante. PVP foi incluído em todas as soluções tampão de importação após digitonina para evitar inchaço osmótica dos núcleos. O núcleo intacto, juntamente com um ambiente controlado citoplasmática, fornece um sistema de transporte muito simplificada que nos permite elucidar a etapa de transporte complicado nuclear a passo. Ensemble anterior e única molécula de experimentos que realizou no sistema têm proporcionado grandes conhecimentos no transporte nuclear.

2. Preparação de proteínas essenciais para a experiência de transporte nuclear

1. Por meio de uma transformação convencionais bacteriana das cepas de E.coli especiais (JM109) foram projetados de forma a superexpressão dos genes responsáveis ​​pelaprodução de proteínas acima de interesse e são mantidos em estoque a -80 ° C. (Para NLS-2xGFP usamos pTrcHisB vetor por Invitrogen). A loopful ou ~ 50 mL de estoques congelados de proteína fluorescente ou carga expressando células de E. coli são transferidos para 5 mL dos meios de comunicação LB com adição de 5μL de ampicilina (U 1000) e cresceu aerobicamente com agitação durante a noite a 37 ° C a 225 rpm.
2. Após 24 horas 500 mL da cultura saturada é transferido para 500 mL de meios LB e abalado nos 37 ° C incubadora de 5-6 horas após a adição de 250 mL IPTG (isopropil _-D-1-thiogalactopyranoside) e incubadas por mais 5-6 horas. É necessário porque IPTG é um metabólito lactose que desencadeia a transcrição do operon lac, onde o gene lacZ é substituído pelo gene de interesse e IPTG é então usada para induzir a expressão do gene.
3. A cultura é, então, girou na centrífuga de alta velocidade de resfriamento a 12000 rpm por 15 minutos eo sobrenadante é descartado. Células são então ressuspendido em 40 mL de CelLytic B (resultados CelLytic B na extração rápida e eficiente de proteínas que são apropriados para purificação de afinidade e análise.) O volume deve basear-se 10 mL por 1 grama de uma pelota. 28 mL de mercaptoetanol é adicionado para quebrar pontes dissulfeto e 400 mL de flúor phenylmethanesulphonyl para desativar proteases de digerir proteínas de interesse após a lise celular. Um "cocktail protease" também é adicionado (400 mL de 0,2 mg / mL pepstatin A. 400 mL de 0,2 mg / mL leupeptin; 400 mL de 2 mg / ml de tripsina inibidor) para garantir que os extratos de proteínas não se degradam antes da análise de metas de interesse. Em seguida acrescentar 400 mL 1M imidazol, é usado para eluir proteínas tag obrigado a íons Ni ligada à superfície dos grânulos na coluna de cromatografia e 1mM de DNase I, usado para degradar DNA único e double-stranded indesejáveis ​​em 5 phosphodinucleotide e oligonucleotídeos fragmentos.
4. Agitar a mistura no escuro em gelo por 30 minutos para permitir um tempo adequado para a reação, giram em 10.000 rpm por 60 minutos na centrífuga de resfriamento. Colheita o sobrenadante e em preparação para cromatografia realizar a infusão com Ni-NTA (níquel-nitrilotriacético Superflow ácido por Qiagen) girando em tubos de centrífuga de microcentrífuga em velocidade máxima por 3 minutos e lavagem com tampão de lise, repetindo fiação e lavar até que a mistura é clara de qualquer tonalidade azul. Agitar a mistura resultante lentamente em um recipiente escuro no gelo por 60 minutos.
5. Realizar a cromatografia de coluna que flui através de 12 frações como segue. A primeira fracção é um fluxo através de 10 mL sobrenadante misturado com Ni-NTA no passo anterior. A segunda é de 10 mL de tampão de lise (50 mM Na-fosfato, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0), de 10 mL de tampão terceiro (10 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0), quarto e os restantes são 0,5 mL de tampão de eluição (250 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0)
6. Prepare o gel de poliacrilamida SDS-PAGE e preparar as nossas amostras através da mistura de 4 mL de uma fração e 1 mL de SB de 5X (Tris 300mM 6.8, BME 25%, SDS 10%, glicerol 50%). Para o padrão que usamos 100 kb DNA ladder por Invitrogen. Antes de carregar nós fervida nossas amostras por 5 minutos. Depois de carregar nós corremos o gel à 120V por 60 minutos. Então nós manchado, descorados e, finalmente, secas em um secador de gel especial para 2 horas a 80C.
7. Em seguida, visto os resultados no gel e localizado as frações que rendeu o melhor resultado. Dependendo da proteína de nosso interesse, as bandas devem estar localizados, respectivamente, para o tamanho de uma proteína. Esta fração deve ser selecionada para a purificação de proteínas ainda mais com MonoQ e Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. A concentração é realizada girando as frações mais concentradas em Nanosep filtro com poros de 10K em 14 rpm por 5 minutos, lavando-a com tampão de eluição de cada vez. É necessário determinar a concentração de proteína utilizando o ensaio final de BSA para o procedimento ainda mais proteína rotulagem.
9. A fluorescência verde intrínseca da NLS-2xGFP não pode ser utilizado para geração de imagens única molécula de transporte nuclear, devido à sua má foto-estabilidade e espectro sobreposto com autofluorescência celular. Assim, nós rotulamos as moléculas de carga com excesso de cisteína reativa corante orgânico (ou Alexa555 Alexa maleimida 647 da Molecular Probes) por 2 horas em temperatura ambiente em 50 mM fosfato de sódio, 150 mM NaCl após a redução com TCEP tris (2 - carboxietil) por 20 minutos. Reações foram apagados, com 2-mercaptoetanol, e as soluções de proteína foram dialisadas para remover o corante livre.

3. Microscopia única molécula

1. Nosso conjunto de microscópio up inclui uma Olympus IX81 equipado com um 1.4 NA objetivo óleo de imersão-100x (UPLSAPO 100XO, Olympus), a 35 mW 633 nm laser He-Ne (Melles Griot), uma lâmpada de mercúrio com GFP filtro de configurar, em um -chip multiplicação ganho da câmera charge-coupled device (Cascade 128 +, Roper Scientific) e the pacote de software Slidebook (Intelligent Innovations Imaging) para aquisição de dados e processamento. Um helicóptero óptico (Newport) foi usado para gerar um modo on-off de excitação laser. GFP e de fluorescência Alexa647 foi animado por uma lâmpada de mercúrio e 633 nm do laser, respectivamente. A emissão de fluorescência verde e vermelho foram coletadas pelo mesmo objetivo, filtrado por um filtro dicróica (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) e um filtro de emissão (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) e fotografado por uma câmera CCD idênticos.
2. Em experimentos única molécula, permitimos que o tempo de fluorescência fotobranqueamento da molécula de carga única a ser mais longos do que o tempo de transporte. Para determinar o tempo fotobranqueamento, 0,1 moléculas de carga nM são semeadas em uma tampa de vidro escorregar e tornar-se imóvel depois de 30 minutos devido à não-específica de absorção. Então, o tempo da fluorescência é medida. Dependendo da proteína de vezes photobleach juros serão diferentes com base no número de cysteins capaz de reagir com Maleimidas, portanto, a intensidade de iluminação e área de iluminação deve ser ajustada de modo a não induzir a uma fotobranqueamento preliminar e garantir que as moléculas de carga rotulada com Alexa mostrar 647 fluorescência por mais tempo do que as cargas interagir com NPCs.
3. Para os experimentos em células permeabilizadas importação, o transporte de carga e cofatores essenciais foram adicionadas. Reações típicas de carga importação contidas GTP 1 mM, 0,5 mM importina, 0,5 mM importina-1, 2 e 1 mM mM Ran NTF2 para o transporte facilitado e 0,1 nM de 10KDa Dextran para transporte passivo .. Concentrações de carga fluorescentes foram> 100 nM em experimentos em massa, e ~ 100 pM para ensaios única molécula. A estas concentrações,> 99% da carga era esperado que formam complexos com importina e importina. Taxa de transporte foi monitorada por epifluorescência (se apenas as taxas relativas foram importantes) ou microscopia de fluorescência confocal (se as taxas absolutas foram desejado).
4. Primeiro a posição do envelope nuclear foi determinada por microscopia de campo amplo de epifluorescência, envolvendo uma lâmpada de mercúrio HBO com um conjunto de filtros GFP para tirar uma foto do NE. As intensidades de pixels dentro de uma linha ou coluna são aproximadamente perpendicular ao NE estavam aptos com Gaussian. As posições de pico da gaussiana para um determinado conjunto de intensidades de pixel foi considerado a posição NE para essa linha e coluna. As posições de pico de uma série de Gaussianas como foram, então, se encaixam com um polinômio de segundo grau, rendendo o caminho do NE na imagem inteira.
5. Uma vez que o NE é localizada, é essencial para se livrar de todos os autofluorescência utilizando um 633 nm laser He-Ne até que esteja completamente Foto-descoloração, geralmente mais de 60 segundos é suficiente.
6. Moléculas da amostra deve, então, ser mantidos em uma solução 1,5% do PVP e da mistura adicionada à câmara de fluxo em um volume de 25 L e depois arrastado através da câmara de aplicação de um pavio de papel de filtro. Um cuidado absoluto deve ser tomado com a adição de proteínas de carga de importação para as células permeabilizadas logo após a localização envelope nuclear já que o foco pode ser facilmente rompido por qualquer movimento vigoroso.
7. Assim que as moléculas de carga são adicionados, 633 nm laser He-Ne foi utilizada para iluminar as trajetórias de transporte de moléculas de trânsito. Um helicóptero óptico (Newport) devem ser envolvidos em cerca de 5 Hz para evitar a fotodegradação devido a uma alta densidade de potência do laser, bem como para permitir que uma nova porção de não-Foto-descoloração moléculas individuais se aproximar do NE. Uma série de vídeos de translocações única molécula deve ser tirada com uma câmera CCD de alta velocidade que pode ir até aos 2500 Hz.

4. Resultados representativos

Realizado corretamente, o nosso protocolo permitiu coletar uma série de vídeos demonstrando a translocação de moléculas de carga única interagindo com o complexo do poro nuclear em permeabilizadas HeLa POM 121 células. (Fig. 1). Nos propusemos a imagem e trilha os passos de transporte de moléculas de dextran transitória através do NPC em células permeabilizadas digitonina-HeLa estável expressando GFP-POM121. Células foram incubadas com baixas concentrações de moléculas de dextran marcado. O plano equatorial do núcleo foi trazida para o foco com uma imagem clara do anel verde da GFP fluorescência animado por uma lâmpada 488-nm mercúrio. A exposição de longa data da GFP-NE nos permite obter um excelente sinal-ruído (SNR) para localizar o avião meio do NE. Anteriormente 10 moléculas de dextrano kDa foram encontrados para difundir através da NE dentro de aproximadamente 2 ms com uma resolução espacial de cerca de 20-40 nm por uma taxa de quadros de detecção de 500 ou 1000 Hz. Tal resolução espaço-temporal permite a captura de apenas 1:59 as etapas de difusão de moléculas de dextran através do NPC que não é suficiente para elucidar informações mais espaço para a difusão passiva. Para capturar as etapas mais fina de moléculas de dextran dentro do NPC com uma melhor spatiResolução otemporal, temos realizado duas melhorias principais: (i) a adaptação de uma taxa mais rápida detecção de quadro de 2500 Hz para capturar passos difusão mais finos, e (ii) a empregar uma maior densidade de iluminação óptica para excitar mais fótons de moléculas individuais para obter uma maior resolução espacial. Estas melhorias nos permitem captar várias etapas de difusão transiente de alexa647 marcado com moléculas de dextran em todo o NE por uma luz laser de 633 nm, em irradiância de 100 kW / cm ² com uma resolução espaço-temporal de 12 nm e 400 ms.

Conforme mostrado na Figura 1, uma série de imagens fixas de eventos de transporte típico de moléculas de dextrano foram registrados. Ao rastrear a trajetória espacial de moléculas individuais que transitam dextran, os passos multa de difusão através da NE foram distinguidos. Descobrimos que existem cerca de 30% dos eventos de interação com o NE reconheceram originários e os compartimentos de destino. Entre eles, as moléculas de dextran movimento do citoplasma para o NE tem dois destinos: fim no núcleo após difundir através da NE ou mover de volta para o citoplasma, após interagir com o NE As situações semelhantes ocorreram em eventos de exportação: as moléculas de dextran a partir do núcleo entram no citoplasma ou difusa de volta para o núcleo após interagir com o NE. Série de imagens como conterá informações sobre a posição espacial das moléculas individuais em relação ao NPC, bem como informação temporal sobre o tempo de permanência das moléculas através do NPC. Ao analisar as trajetórias das moléculas de dextran em torno da área do NE, freqüência o tempo de transporte, eficiência e entrada pode ser determinada. O tempo de transporte em nosso trabalho pode ser identificada como a importação ou o tempo de exportação. Eles foram definidos como o tempo médio de permanência de moléculas de dextran dentro do NPCs que se submetem a importação ou exportação. A importação ou exportação de eficiência foi definida como o percentual de importação completa ou os eventos de exportação sobre a soma dos eventos completo e abortiva. A freqüência de entrada de importação ou exportação refere-se o número de moléculas que interagem com o NE durante um segundo.

Figura 1. Quadros de vídeo selecionados de eventos de transporte típico de moléculas de dextrano através da NE. (A) Um evento citoplasma-to-núcleo. Uma molécula de dextran único (mancha vermelha) iniciado a partir do citoplasma, interagiu com o NE (linha de pixel verde), e terminou no núcleo. As trajetórias do evento (linhas azul e pontos abertos) foram determinadas e sobrepostos com o NE (linha preta). As linhas verde e vermelho representam a distância de 100 milhas náuticas a partir do NE no citoplasma e do lado nuclear. C, o citoplasma. N, o núcleo. Barra de escala: 2 mm. (B) Um evento de citoplasma a citoplasma. (C) Um evento de núcleo para núcleo. (D) o evento A-núcleo de citoplasma.

Discussion

Cuidados devem ser tomados para assegurar uma co-localização adequada de moléculas NE e único durante o experimento. Também é importante para fornecer um sinal de ruído elevados, especialmente quando o sinal é baixo, devido à rotulagem pobres ou fotodegradação. Precisão de localização é limitada pelo ruído de fundo (decorrentes de fora de foco de fluorescência, CCD ruído de leitura, escuro fatores corrente e outros).