Summary
Neisseria meningitidis (NM), g 부정적인 인간 특정 호흡기 병원체가 인간 α - actinin에 바인딩할 수 있습니다. 여기 우리는 인간의 뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)에 세균 입국 후 α - actinin 세포와 세균의 colocalisation의 시각화를위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
Neisseria meningitidis (NM, 수막염)의 OPC 단백질은 adhesin 인간 상피 및 내피 세포에 대한 효과적인 invasin 역할을 수있는 표면 표현 적분 외부 막 단백질이다. 우리는 OPC와 같은 vitronectin으로 인테 그린의 리간드 먼저 바인딩하는 OPC을 요구하는 과정을 주요 수용체로 이들에게 휴대 표현 수용체 하나를 통해 내피 표면에 위치한 integrins을 확인했습니다. 이 과정은 내피 세포의 세균 침입이 발생합니다. 최근, 우리는 인간의 세포 3 전체 세포 lysates에서 찾을 100kDa 단백질과 OPC의 상호 작용을 관찰했다. 숙주 세포의 단백질은 전기 영동에 의해 분리하고 nitrocellulose에 blotted OPC - NM 표현과 중첩했을 때 우리는 처음이 상호 작용을 관찰했다. 상호 작용은 직접했고 중간 분자를 포함하지 않았다. 질량 분광법으로, 우리는 α - actinin로 단백질의 신원을 만들었습니다. 어떤 표면이 표현 없기 때문에 α - actinin은 검사 8 셀 라인의 어느 발견하고, 대상 세포에 세균 항목으로 혈청 리드의 면전에서 내피 세포와 OPC의 상호 작용으로, 우리는 intracellularly 상호 작용하는 두 단백질의 가능성을 조사했다. 이를 위해, 교양 인간의 두뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)는 OPC - 표현 연장 기간과 internalized 세균과 α - actinin의 위치에 대한 NM 것은 공촛점 현미경으로 검사되었습니다에 감염되었습니다. 우리는 박테리아 internalisation의 여덟 시간 동안 후 상당한 있었던 cytoskeletal 단백질과 NM의 colocalisation 시간 종속적인 증가를 관찰했다. 또한, 양적 이미징 소프트웨어의 사용은 우리가 α - actinin 및 기타 cytoskeletal 단백질과 NM의 colocalisation의 상대적인 측정을 얻을 수있었습니다. 절차는 또한 인간의 상피 세포에 적용할 수 있지만 여기서 우리는, 시각화 인간 내피 세포로 세균 입국 후 세포내 단백질과 세균의 colocalisation의 부량을위한 프로토콜을 제시한다.
Protocol
1. Immunofluorescence 프로토콜
심는 감염 및 단백질 염색법
다음 절차는 적절한 안전 수준의 조직 문화와 미생물 실험실 시설을 필요로합니다.
1 일
감염 대상 세포의 A. 준비
- 유리 coverslips 50 %의 합류 (~ 1.5x10 4 셀 / cm 2) (16mm 직경)에 씨앗 HBMECs은 12 잘 플레이트 (물론 3.8 cm이 성장 지역 /)에 배치.
성장 매체 : RPMI 1640는 15 %의 열 inactivated (56 ° C, 30 분) FBS, 2 MM의 글루타민, 1 MM 나트륨 pyruvate, 100 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % (V / V) 멤 아닌 필수 아미노산과 보충 지방산 솔루션, 1 % 멤 비타민 솔루션입니다. - 37 박 (O / N)를 통해 문화 ° C, 5 % CO 2 배양기 인치
B. 세균성 문화
- 관심의 변형 성장을 37 10 % 온수 말 피가 보충에 필요한 매체 예 : 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트에서 O / N (16-18 H) ° C 5 % CO 2 분위기 4인치
DAY 2
박테리아 (N. meningitidis) 정지 A. 준비
- 10 μL 문화 루프를 사용하여, 2 ML PBSB (칼슘, 마그네슘과 PBS)에서 밤새 세균성 문화의 정지합니다.
- 대형 박테리아 집계는 실온 (RT)에서 5 분 서 정지를 떠나하여 해결하도록 허용합니다.
- 펠렛을 방해하지 않고, 멸균 튜브에 정지의 상위 1 ML (재고 inoculum)를 전송합니다.
- 주식 inoculum에서 박테리아 숫자를 계산하려면, 0.1M NaOH에 1퍼센트 SDS의 1mL 볼륨을 포함하는 튜브에 aliquots (20-50 μL)을 추가하고 solubilise에 부드럽게 섞는다.
- 260nm (A260)에서 흡광도를 결정하여 솔루션의 핵산 함량을 측정. 우리 손에 1에 해당하는 5x10의 A260 8 식민지가 단위를 형성 / ML (cfu / ML). 이것은, PBSB의 재고 inoculum의 dilutions 일련의 준비 한천 플레이트 위에 도금 및 O / N 부화 후 식민지를 세어 확인하실 수 있습니다.
- 감염 매체의 재고 inoculum의 나누어지는을 희석 [(2 %를 보충 M199 decomplemented (56 ° C, 30 분) 정상적인 인간의 혈청 (NHS)] 대상 세포의 감염에 필요한 박테리아 밀도를 얻을 수 있습니다.
- 저희 연구실에서 대상 셀 당 200-300 박테리아의 감염 비율은 일상적으로 사용됩니다.
B. 셀 문화 감염
- 항생제의 모든 흔적을 제거하는 행크의 중간과 교양 대상 세포를 3 회와 coverslips 씻으십시오.
- 5% CO 2, 37 3 H 8 H에 대한 신선한 박테리아 suspensions (위에서 설명한) ° C와 세포를 감염.
- 감염 기간의 끝에, 4 RT 또는 O / N에서 30-45 분 2 % paraformaldehyde 500 μL (PFA)에 PBS로 세포를 세 번 씻고 수정 ° C.를
- 위에 표시된 농도와 시간에 Paraformaldehyde의 고정은 세균과 세포 형태학의 보존에 적합한 것으로 발견되었습니다.
- paraformaldehyde를 세척 후, 트리톤은 X - 100 10 분 PBS에 희석 0.1 %의 잠복기하여 paraformaldehyde - 고정 세포를 permeabilise.
- PBS로 샘플을 3 번이나 씻으십시오.
- 단백질 얼룩을 진행하거나, 또는 4 1% BSA / PBST O / N 500 μL의 시료를 남겨 ° C.
3 일
단백질 얼룩
세포내 박테리아 얼룩 다음과 같이 α - actinin은 적절한 기본 및 보조 항체의 사용에 의해 순차적으로 또는 동시에 수행할 수 있으며 모든 절차는 12 잘 접시에서 진행하실 수 있습니다.
- 3퍼센트 500 μL와 permeabilised 세포를 포함하는 coverslips를 차단 RT에서 30-60 분 BSA / PBST (PBS는 트리톤 X - 100 0.05 %를 포함)
- PBS로 세척 후 12 잘 플레이트의 새로운 드리 웰 각 coverslip을 전송하기만하면됩니다.
- 박테리아와 α - actinin에 대한 기본 항체를 추가하며 coverslip의 표면을 커버하기 위해 신중하게 추가할 경우 coverslip 당 항체의 80 ~ 100 μL가 충분합니다. 실온에서 1 시간을위한 부화.
- 우리는 동시에 α - actinin (Abcam)에 대해 Neisseria meningitidis (연구소 - 사육) 및 마우스 단클론 항체 (mAb)에 대한 토끼 polyclonal 항혈청를 사용합니다. 어떤 실험에서, 안티 α - actinin 대신에, 굴지 또는 vimentin에 대한 mAbs는 (시그마) 사용되었습니다.
- 부화의 마지막에는, 잘하는 PBS 200 μL를 추가할 뉴 웰이 포함된 500 μL PBS에 coverslip과 장소를 리프트.
- 5 분 후 pipetting으로 PBS를 제거한 다음 신선한 PBS를 추가합니다. 두 번 반복합니다. 에 coverslips을 전송새로운 드리 웰.
- 어둠 속에서 1 시간을위한 RT에서 품어, 1% BSA / PBST에 희석 다른 fluorochromes하는 복합 적절한 보조 항체를 추가합니다.
- 세균 검출을 위해 우리가 TRITC에 복합 백신 토끼 IG를 사용하고 α - actinin 및 기타 cytoskeletal 단백질 감지, 우리가 복합 백신 마우스 IG를 사용 중 FITC - (시그마) 또는 알렉사 플루어 488 - (Invitrogen).
- 부화의 끝에, 4 단계와 5 단계에로 씻으십시오.
- 어둠 속에서 RT에서 5 분 0.6 μg / PBS에 ML DAPI (DNA가 얼룩)와 얼룩 카운터.
- PBS와 린스.
- 장착 매체의 한 방울과 함께 슬라이드 (E, G. Mowiol 또는 Vectashield)에 마운트 coverslips (세포가 아래로 향하게)
- 4 어둠 속에 보관 ° C.
- 샘플은 현미경 관찰을위한 준비가되어 있습니다.
2. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)
관찰하고 세포내 세균 및 cytoskeletal 요소의 이미지를 캡처하려면, 우리는 Leica DM I6000 거꾸로 epifluorescence 현미경에 부착된 Leica SP5 - AOBS 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 immunolabelled 샘플 촬영된 이미지를 사용합니다. 모든 이미지는 Leica 소프트웨어와 63x NA 1.4 기름 침지 객관적이고 공정을 사용하여 수집되었습니다.
CLSM 절차 :
- CLSM 절차를 시작하려면 목표에 침지 기름 한 방울을 추가하고 현미경 단계에 표본 슬라이드를 coverslip 측 다운 놓으십시오.
- 비주얼 모드로 현미경을 설정하고 현미경의 눈 조각을 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
- Leica 소프트웨어를 사용하여 XYZ 수집 모드를 선택합니다.
- 512 X 512 포맷 (프레임 크기)를 선택합니다. colocalisation 연구 들어, 높은 해상도, 더 정확한 이미지, 마음의 현미경의 해상도 제한을 유지. 다음 스캔 속도를 높일 수 양방향 X 모드를 선택하고, 사진 표백을 줄일 도움이됩니다.
- 순차 스캔 설정을 설정할 수 있습니다. "seq"기능을 클릭하여 스캔 모드 중 하나를 선택합니다. 우리는 모드 "라인 사이"를 사용합니다.
- DAPI (파란색), TRITC에 대한 알렉사 플루어 488 (녹색)와 561 nm의 (적색)에 대한 488 nm의에 대한 405 NM : 선택 레이저 보조 항체에 복합 fluorochromes에 따라 들보. Photomultiplier 튜브 (PMT) 각각 1, 2, 3, 활성화. 올바른 방출 파장을 감지하는 PMT 설정을 조정합니다.
- Z - 스택 또는 일련의 상단 ( "시작")와 바닥 ( "종료") 설정합니다. 다음, 필요한 "Z - 단계 크기"를 설정합니다.
- Neisseria meningitidis는 diplococcus (그림 1G)입니다 각 구균은 0.5 μm의의 대략적인 지름을 가지고 있기 때문에, 0.20 μm의의 Z - 단계 크기는 적어도 두 번은 각 구균 스캔의 확률을 향상시키기 위해 선정되었습니다. 0.2 μm의 - 그것은 0.1의 최적 해상도를위한 단계 크기 이내에 있습니다.
- 노이즈 비율로 신호를 향상시키기 위해 3 라인 평균을 선택하여 최종 검사 매개 변수를 설정합니다.
- "시작"을 클릭하여 이중 또는 삼중 묻은 이미지는 다른 chromophores 간의 상호 대화를 제거하는 다른 파장의 연속적인 스캔하여 얻을 수 있습니다.
- 이 fluorochromes의 colocalisation의 표시 들어, 하나의 이미지로 선택한 채널을 병합하려면 '오버레이'기능을 선택합니다 예를 들어, 알렉사 488 (녹색) 및 TRITC (적색) fluorochromes 모두 colocalise 때 노란 색깔은 중첩 이미지에 나타납니다 .
- 가능한 colocalisation를 시각화에 필요한 2D 이미지의 건설을위한 "최대 프로젝션"기능을 이용하여 Z - 스택 또는 시리즈를 컴파일합니다. colocalisation의 더 자세한 분석은 각 광학 부분의 분석에 의해 얻을 수 있습니다.
- Z - 스택 또는 시리즈를 인수 후, 다양한 요소의 세포 지방화 (그림 1E)의 시각화를위한 직교 이미지를 얻기 위해 데이터를 처리합니다.
3. Colocalisation의 부량
공촛점 스캐닝 현미경 이미지의 통계 분석은 Volocity 소프트웨어 (순발력, PerkinElmer)로 수행됩니다. 이 소프트웨어는 멘더스 외. (1993) 5 설명된 colocalisation 분석을 위해 특별히 설계된 도구를 제공합니다. 디지털 형광 이미징의 맥락에서 Colocalisation는 각 채널에 동일한 voxel (픽셀 볼륨) 위치에서 신호의 검출이라고 할 수 있습니다. 두 채널은 동일한 샘플 영역 (Volocity 사용자 가이드)에서 촬영한 두 가지 fluorochromes의 이미지들로 만들어집니다. 통계 분석은 아래에서 설명 양적 Colocalisation 분석을 사용하여 Volocity 소프트웨어 (순발력, PerkinElmer)로 수행됩니다.
양적 Colocalisation 분석
- Volocity 소프트웨어를 사용 CLSM 이미지와 라이브러리를 만듭니다.
- 메뉴 표시줄에있는 이미지에서 "확장 포커스"를 선택하십시오. 이 도구는 분석하는 2D 이미지에서 Z - 스택을 컴파일.
- "Colocalization"도구를 선택합니다. 분석하는 두 채널은 같은 색 농도가 있어야합니다.
- 그것이 계량 될되는 영역을 선택합니다. 어떤 배경을 제거하는 임계값을 설정합니다.
- "colocalization를 생성합니다"를 선택하여 colocalisation 출력을 만듭니다. Colocalisation 통계는 이전에 다음 ID로 선택한 관심 지역에 대해 생성됩니다.
- 선택 멘더스 '계수 R (계수를 중복)와 내 (colocalisation 계수).
- 멘더스 '계수들은 총 픽셀 강도에 대한 표준 있으므로 얼룩의 강도로 구분하지 않습니다, 따라서 그들은 한 항원의 얼룩은 다른보다 강력한 경우 고용 수 있습니다.
- 멘더스 5,6에 따라 계수 R을 중복하는 것은 colocalisation의 진정한 정도를 나타내는 픽셀의 총 개수와 비교 colocalise 픽셀의 수를 즉.
- 반면에, colocalisation 계수, 내이 덜 풍부한 잔기 (이 경우 세균에 빨간색)에 더 풍부한 잔기 (이 경우 α - actinin, 녹색)의 형광 기여를 설명, 빨간색 픽셀의 수를 즉, 그 빨간 픽셀의 총 개수와 비교 녹색 픽셀과 중복됩니다.
- 멘더스 '계수 1 높은 colocalisation, 0중인 없음 있기 때문에 1과 0 사이의 범위,하지만 그들은 쉽게 해석에 대한 비율로 표현할 수있다.
- 데이터를 프레 젠 테이션을위한 Excel 문서로 내보내기 통계 값.
4. 대표 결과
OPC - Neisseria meningitidis 표현과 α - actinin의 세포내 현지화
으로 α - actinin과 (표시되지) 3 H 감염 실험에 덜 자주하는 등장 NM의 표시 colocalisation 위에서 설명한 3 8 시간 NM에 감염된 인간의 두뇌 microvascular 내피 세포의 공촛점 이미징 8 H에 대한 감염 문화에 비해 ( 그림 1 AF). OPC - 표현 meningococci과 α - actinin의 논증할 수있는 colocalisation는> 5 복제 실험에서 각 시간을 관찰했다. 위에서 설명한 여러 공촛점 이미지를 사용 colocalisation의 통계 분석이 수행되었다. 전체 HBMEC에서 OPC - 표현 meningococci를 더 그린 (α - actinin)과 빨간색 (NM) 픽셀의> 25 % 중복이 (그림 2B, 계수 R을 오버랩) 얻은 감염. vimentin은 희귀했다와 internalized 박테리아와 굴지이나 vimentin 중 하나의 라벨이 수행어진 α - actinin, 실험에 대조적으로, 가끔 colocalisation는 굴지과 함께하지만 그 관찰되었다 (Figure. 2B).
데이터는 또한 계정으로 각 잔기의 상대 풍부한 소요 계수 내를 사용하여 분석되었다. 내가 더 풍부한 신호 (이 경우 그린, α - actinin에서) 덜 풍부한 신호 (이 경우 빨강, 박테리아)를 발생 때마다 발생의 빈도를 측정하기위한 한 방법입니다. 이 법안은 internalized meningococci (그림 2A 및 C)의 주변에 α - actinin의 발생의 인상 수준을 보여줍니다.
그림 1. N.의 세포 상호 작용을 평가하기 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 α - actinin과 meningitidis. AH. coverslips에 성장 콘플루앙 내피 monolayers는 OPC - 표현 (AF) N. 감염된 meningitidis. 8 H 후, 비 점착 성의 박테리아를 씻어 있었다 전지 paraformaldehyde로 고정하고 0.1 % 트리톤 X - 100 permeabilised. 위에서 설명한 후, 박테리아와 α - actinin은 (; 세균, 빨강, α - actinin, 녹색) 스테인드되었습니다.
AC. NM (A) 또는 α - actinin (B)의 위치의 XY 이미지를 보여주는 한 분야. (C)의 오버레이 이미지가 노란색 오렌지색 색상 colocalisation을 제안 나타나는 몇 가지 영역을 나타냅니다. 에서 화살표 (A)와 (B) α - actinin의 축적의 높은 수준은 세균 주위에 발생했을 것으로 보인다 영역을 보여줍니다.
세포의 기지에 위치한 세포내 세균 주위에 감염된 HBMEC의 monolayer 표시 colocalisation의 D. 광학 해부.
일반적인이 지역의 α - actinin의 얼룩으로 다시이 colocalisation 낮은이며, α - actinin의 사고로 인해 근접하지 않습니다.
위와 같이 처리 감염된 HBMEC monolayers의 E와 F.는 3 차원 이미지를 표시합니다. 혀끝의 표면 (E)의 경사보기 자기편 박테리아를 보여줍니다 스테인드 빨간색 (적색 화살표) 내피 세포 (노란색 화살표)의 기저 표면을 향해있는 몇몇 박테리아가 독특한 오렌지 / 색상 노란색 반면. 기초 위치가 좀 더 명확하게 (F) 어떤이 최종에 XZ 단면이다에서 볼 수 있습니다.
G. N.의 부정적인 스테인드 전자 현미경 이미지 그것을 보여주는 meningitidis에서 주된 diplococcal. 각 구균은 직경 약 0.5 μm의 수 있습니다.
그림 2. HBMEC 세포에 Localisation과 α - actinin, 굴지과 vimentin의 배포.
위의 전설에서 설명한지만, α - actinin 이외에, 일부 coverslips가 α - actinin에 대해 비슷한 절차에 의해 굴지이나 vimentin의 검출에 사용되는 것처럼 HBMEC의 A. 감염된 monolayers이 치료되었습니다. 위와 같이, α - actinin 여러 internalized 박테리아 (흰색 화살표) 주위 집중. Vimentin과 굴지는 감지할 수있을 정도의 수준으로 박테리아와 colocalise하지 않았다. 바 20 μm의를 나타냅니다.
계수 R과 나의위한 B. & C. 값은 위에서 설명한 Volocity 소프트웨어를 사용하여 3 개 실험에서 얻은되었습니다.
Discussion
의 결합의 가능성 internalized OPC - α - actinin 표현하는 Neisseria meningitidis의 것은 박테리아의 colocalisation의 심사 3과 8 H의 잠복기 후 감염된 세포에서 cytoskeletal 단백질에 의해 HBMEC를 사용하여 탐색했다. 공촛점 현미경으로, α - actinin과 Neisseria meningitidis의 colocalisation은 증명 수 있습니다. 세균은 3 H에 internalized 있었지만 특히,이 시점에서 α - actinin과 작은 colocalisation있었습니다. cytoskeletal 단백질과 박테리아 협회 8 H 감염 기간이 지나면 같은 세포내 체류 긴 기간을 필요로 나타나, 세균의 큰 숫자는 가까운 협회에서 분명히 α - actinin했다. 알파 actinin은 다기능 단백질이며, cytoskeletal 요소 세균 상호 작용은 현재 연구 주제는 대상 세포 기능에 중요한 영향을 수 있습니다.
위에서 설명한대로 colocalisation의 부량는 세심한 표본 준비가 필요합니다. 특히주의가 기간 및 항체 dilutions을 차단, 표본의 고정 부여해야합니다. 노이즈 비율 가장 좋은 신호를 각 주 및 보조 항체가 최적 농도를 결정하는 예비 실험에서 titrated해야합니다. 우리의 경험에서 장착 중간 Mowiol 더 나은 이미지를 생산.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구는 웰컴 트러스트와 수막염 영국에 의해 투자되었다. HBMEC 세포 라인은 박사 KS 김에 의해 제공되었다. 공촛점 이미징 및 전자 현미경은 울프슨의 Bioimaging 시설, 브리스톨 대학에서 수행되었다. 우리는 또한 그들의 도움과 조언을 미스터 앨런 리어드 박사 마크 젭슨 (브리스톨 대학), 그리고 앨런 씨가 틸리 (PerkinElmer)을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well plate | Corning | BC311 | |
| Glass Coverslips | VWR international | 631-0152 | |
| BHI AGAR | LAB M | LAB048 | |
| M199 | Sigma-Aldrich | M2154 | |
| RPMI 1640 | Lonza Inc. | BE12-167E | |
| MEM Non Essential Aminoacids | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| HANK’S balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H9269 | |
| FBS | BioWhittaker | DE14-801F | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| MEM Vitamin solution | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| PBSB | Lonza Inc. | BE17-513F | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | P/0840/53 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9564 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Anti‑Nm antiserum | Laboratory raised | Rabbit serum | |
| TRITC anti-rabbit Ig | Sigma-Aldrich | T6778 | |
| Anti α‑actinin mAb [7H6] | Abcam | Ab32816 | IgG |
| Anti actin mAb | Sigma-Aldrich | A4700 | IgG2a |
| Anti vimentin mAb | Sigma-Aldrich | V6630 | IgG1 |
| ALEXA FLUOR 488 anti‑mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| FITC anti-mouse IgG | Sigma-Aldrich | F-2012 | |
1. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM): Leica SP5 confocal imaging system: This system, by using a combination of AOTF (acousto-optical tuneable filter) and an AOBS (acousto-optical beam splitter), simplifies excitation with specific wave lengths. 2-Software: Leica confocal software LCS, Leica Microsystems, Germany. |
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References
- Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions. Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).
- Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides. Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).
- Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin. Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).
- Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells. Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).
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- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).
