Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Summary

Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Este vídeo mostra passo-a-passo os procedimentos de como manipular embriões medaka, incluindo dechorionation, montagem em agarose para a imagem latente e transplante de células para a produção de quimeras. Estes procedimentos são essenciais para a utilização medaka zebrafish e em um laboratório para tirar o máximo proveito de seus recursos complementares para a análise genética de funções genoma dos vertebrados.

Abstract

Medaka é um pequeno peixe de água doce do egg-laying que permite que ambas as análises genéticas e embriológicas e é um dos três organismos modelo vertebrados em que genome-wide-driven fenótipo mutante telas foram realizadas ^1. Divergência de sobreposição funcional de genes relacionados entre medaka zebrafish e permite a identificação de fenótipos romance que não são identificáveis ​​em uma única espécie ^2, assim medaka e peixe-zebra são complementares para a análise genética das funções genoma dos vertebrados. Manipulação de embriões medaka, como dechorionation, embriões de montagem para a imagem latente e transplante de células, são procedimentos essenciais para o trabalho em ambos os medaka zebrafish e em um laboratório. Transplante de células analisa autonomia de células de mutações medaka. Quimeras são gerados através do transplante de células marcadas a partir de embriões de doadores em embriões destinatário sem rótulo. Células do doador podem ser transplantadas para áreas específicas dos embriões destinatário com base no destino mapas ³ para que clones de células transplantadas podem ser integrados no tecido de interesse durante o desenvolvimento. Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Neste vídeo, vamos mostrar os procedimentos detalhados para manipular embriões medaka.

Protocol

1. Desenvolvimento dos embriões

1. Quando eles são postos, os ovos são agrupados por causa de filamentos penhora sobre o córion. Para permitir que os embriões se desenvolvem normalmente, é necessário separar os ovos. Emaranhado de filamentos e cortar anexo mantendo os filamentos anexo com duas pinças.
2. Depois de desagrupamento, os ovos são separados a partir de fezes e algas e transferidos para o meio do embrião fresco a uma densidade máxima de 40 ovos por seis centímetros placa de Petri.
3. Embriões Medaka desenvolver um pouco mais lento que o peixe-zebra a 27 ° C. O tempo de incubação é diferente entre as duas espécies; embriões medaka hatch do córion em 7 dias e iniciar imediatamente a nadar e comer, enquanto embriões zebrafish eclodem em dois dias, mas começar a nadar e comer em 5-6 dias. Desenvolvimento de medaka é encenado de acordo com a ⁴ Iwamatsu do teste.
4. O desenvolvimento de embriões medaka pode ser convenientemente ajustado para planos experimentais, selecionando a temperatura adequada. Desenvolvimento de embriões medaka pode ser interrompido a 4 ° C no início do desenvolvimento. Após a fase 24, quando começa a batida do coração, o desenvolvimento pode ser retardado com uma temperatura mínima de 18 ° C.
5. O tempo de aparecimento de órgãos / tecidos é um pouco diferente em comparação com medaka zebrafish, ou seja, somitogenesis medaka ocorre após o início do desenvolvimento do cérebro enquanto que em somitegenesis zebrafish precede o desenvolvimento do cérebro.

2. Remoção do córion

Córion de medaka consiste em duas camadas de proteção com uma camada dura interna e uma superfície macia exterior. Assim, um tratamento de protease de duas etapas empregando pronase e enzima incubação é necessário eliminar essa córion.

Uma vez dechorionated, os embriões devem ser mantidos em 1X BSS. Semi-estéril condições irão reforçar a cultura de embriões dechorionated sucesso, especialmente quando períodos mais longos de observação são necessários. Estes incluem o uso de soluções estéreis (por exemplo, esterilizados 1X BSS com antibióticos) e ferramentas esterilizadas com etanol 70% seguido de lavagem com 1X BSS.

Como embriões dechorionated medaka são mais suaves e mais frágil do que embriões zebrafish dechorionated, cuidados extras devem ser tomados para garantir que eles não entrem em contato com o ar ou bolhas na pipeta, pois isso irá causar colapso imediato. Para garantir o mínimo dano aos embriões, um de boca larga calor pipeta de vidro polido com bomba pipeta deve ser usado para a transferência de embriões e um laço do cabelo deve ser utilizado para orientar os embriões para a observação. Pratos não aderente Petri deve ser usado para evitar embriões de fixação em superfícies.

1. Antes de dechorionation deve ser verificado que os ovos foram suficientemente separados e limpos-up.
2. Uma vez que ambos pronase e enzimas de incubação são proteinases, eles devem ser mantidos em gelo e minimizar a exposição de embriões para estas enzimas.
3. Transferência de ovos para lixa (P2000 tamanho do grão, à prova d'água) colocado na tampa de uma placa de Petri nove centímetros. Remova o meio de excesso, mas garantir um volume suficiente permanece como para evitar a secagem de embriões.
4. Rolo delicadamente embriões por cerca de 45-60 segundos para remover alguns dos cabelos superfície externa e levemente marcar a superfície do córion (Figura 1). Transferência de embriões de volta para placa de Petri original e examinar.
   
   Quando os embriões rolando no lixa usar o dedo indicador, aplicando o mínimo de pressão e manter paralelo dedo para a superfície de papel de areia. Não enrole mais de embriões 5-7 ao mesmo tempo. Esta precaução irá minimizar o risco de esmagamento embriões um embaixo do outro.
   
   
5. Substituir médio do ovo no prato com pronase 20mg/ml e embriões incubar por 40-60 minutos a 27 ° C.
   
   Garantir os embriões são suficientemente cobertos pela pronase e uma tampa está presente no prato. Pronase não utilizados devem ser mantidos em gelo durante esta etapa para minimizar auto-digestão e pode ser reutilizado até que a atividade é perdido (cerca de 1-2 semanas).
   
   
6. Recuperar pronase para reutilização e embriões lavar 5X em meio embrião para remover traços de pronase como isso irá inativar a enzima incubação a ser adicionado.
7. Remova o meio de embriões e embriões cobrir com a enzima incubação, garantindo embriões sentar-se como uma monocamada no prato.
   
   Se os ovos se sentar em cima da outra no prato, aqueles na parte inferior será esmagado como o córion se dissolve. Mantenha enzima incubação não utilizados no gelo.
   
   
8. Incubar os embriões a 27 ° C e após 15 minutos verificar periodicamente o progresso da incubação utilizando um estereomicroscópio.
   
   Será visto que uma série de cratera lunar, como os buracos começam a aparecer na camada interna do córion, que logo se dissolve após esta deixando a camada externa macia do córion facilmente removido manually. Todo o processo de incubação pode levar 15-60 minutos.
   
   
9. Assim que os embriões saem do córion, a transferência de embriões para uma placa de Petri contendo 1X BSS.
   
   Garantir a não transferir para a incubação da enzima 1X BSS tocando a ponta da pipeta na superfície do BSS permitindo que os embriões gentilmente roll out.
   
   
10. Uma vez que todos os embriões são transferidos de incubação da enzima, fazer uma transferência definitiva para outro prato de doce de 1X BSS.
    
    Isso garante embriões não estão expostas a quaisquer vestígios de incubação da enzima, pois isso irá danificar embriões expostos. Uma vez neste prato final de qualquer embrião ainda possuir a camada externa do córion podem ser liberados manualmente usando micro-pinças esterilizadas sob o estereomicroscópio.
    
    Se os embriões precisam ser desenvolvidos dechorionation seguintes, de penicilina / estreptomicina deve ser adicionado ao BSS para prevenir o crescimento bacteriano.
    
    

Figura 1. Comparação de embriões laminados e desenrolou durante dechorionation. Observar como os embriões rolou no painel B falta os cabelos visto na embriões desenrolou no painel A.

3. Montagem embriões dechorionated

Incorporação de agarose é útil para longos períodos de imagem (por exemplo, imagem em tempo-lapso) para embriões vivos, bem como para observações detalhadas dos embriões fixo. Durante a gastrulação e organogênese inicial (fase 14 para estágio 28), os embriões medaka apresentam ondas de movimentos rítmicos contrátil do outro lado da periderme, uma camada de tecido que cobre tanto embrião do desenvolvimento e da gema ^5. Embriões são tratados com 3,5 mm 1-heptanol para parar os movimentos contráteis ^6.

Para interromper a circulação de embriões após a etapa 28 (64hpf), os embriões são anestesiados pela adição de gotas de tricaina mesilato (TMS), antes de incorporação. TMS também é adicionado à agarose (adicione apenas uma quantidade mínima, esta dose precisa ser otimizado, cerca de uma diluição de 1:25).

1. Descongelar uma pequena quantidade de 3% de baixa temperatura de gelificação agarose (em 1X BSS) por aquecimento a 37 ° C e mantida a esta temperatura.
2. Os seguintes passos precisam ser realizadas rapidamente para garantir que a agarose não se solidifica antes de orientar o embrião. Usando um de boca larga transferência pipeta de vidro agarose derretida suficiente para preencher a depressão tampa de um tubo Eppendorf.
3. Transferência de um embrião dechorionated à depressão cap minimizando transportando mais de BSS com o embrião. Imediatamente a captação do agarose e embrião da depressão tampa e transfira para uma câmara de cultura de Petri.
   
   A placa de Petri 3,5 centímetros com uma janela de vidro no fundo é usado. Para geração de imagens usando um microscópio invertido, os embriões são viradas para baixo do corpo orientado e colocou perto da tampa de vidro. Para geração de imagens usando um microscópio na posição vertical, a espessura da agarose é minimizado.
   
   
4. Transferir a placa de Petri 3,5 centímetros em um prato de 14 centímetros de diâmetro Petri contendo gelo e água (água cheio até cerca de 1 / 3 da profundidade total de prato grande). Enquanto segura a câmara com firmeza na parte inferior da placa de Petri 14 centímetros, use um laço do cabelo suavemente para orientar o embrião como desejado na agarose derretida e mantenha o embrião até a agarose solidifica suavemente levantar e abaixar o prato menor para sua posição original na água gelada.

4. O transplante de células em embriões medaka

O objetivo deste procedimento é determinar se o gene de interesse atos células autonomamente (dentro de uma célula) ou não de células-autônoma (entre as células).

Células do doador podem ser rotulados com um corante como traçador rodamina-dextran antes do transplante (como descrito em 'microinjeção de embriões Medaka "o protocolo JOVE de acompanhamento) ou uma cepa transgênica com a expressão GFP pode ser utilizada, permitindo avaliação de transplante. Uma combinação de duas técnicas de rotulagem é frequentemente útil para superar auto-fluorescência, que pode ser encontrado. Por lapso de tempo de estudos após o transplante, a expressão GFP é particularmente útil.

Use uma pipeta de vidro de boca larga com uma pipeta bomba de todo este procedimento e esterilizar todos os instrumentos (incluindo slides) de antemão com EtOH 70% seguido de enxaguamento com estéril 1X BSS. Embriões destinatário são normalmente desenvolvidas para cerca de estágio 12 como o que permite a discriminação dos pólos ventral e dorsal ao realizar o transplante.

1. Início dechorionating embriões 1,5 horas antes do transplante e aparelhos de injeção de instalação durante as incubações enzima.
2. Coloque uma lâmina de microscópio cavidade em um prato de nove centímetros de diâmetro Petri. Adicionar uma pequena quantidade de metilcelulose de 3% para o centro do slide cavidade usando uma ponteira de pipeta estéril e espalhada pouco.
3. Metilcelulose secar por cerca de 1-2 minutos.
4. Adicionar 350μl de 1X estéril BSS para preencher a depressão slide.
5. Transferência de um embrião doador e até quatro embriões destinatário para o slide com uma pipeta de vidro.
6. Embriões orientar usando um loop para que o cabelo blastoderma do embrião é voltado para cima.
   
   Embriões podem ser inclinou-se uns contra os outros para aumentar a estabilidade adicional.
   
   
7. Insira cuidadosamente o micro-agulha em blastoderma doador e, lentamente, a captação 10-20 células.
8. Suavemente inserir a agulha em área necessária de blastoderma embrião destinatário e expelir as células lentamente. Grande cuidado deve ser tomado quando da inserção de células no blastoderma destinatário de forma a não perturbar a célula-yolk sac fronteira como isso irá resultar em morte do embrião.
9. Despeje esterilizados 1X BSS em placa de Petri.
   
   Com cuidado, despeje o BSS no prato o mais próximo possível do lado do prato possível, de modo a não perturbar os embriões. Nunca despeje o BSS diretamente sobre os embriões e adicione BSS suficiente para que o slide e embriões são imersos.
   
   
10. Adicionar 100μl de penicilina estreptomicina / para o prato e cubra. Transferir cuidadosamente para um prato de 27 ° C incubadora para permitir o desenvolvimento normal.
11. Embriões podem ser observados periodicamente, conforme desejado. Ao usar o transplante para a realização de ganho de função e / ou experiências de resgate fenótipo, algumas mudanças morfológicas observadas podem ser devido aos efeitos do transplante. Assim transplantes múltiplos são necessários. Depois de 2-3 dias, melanóforos devem estar presentes no saco vitelino, cabeça, olhos e tronco. Se presente em embriões transplantados em seguida, uma quimera sucesso foi provavelmente produzido (Figura 3).

Se necessário, embrião doador genótipo (s), transferindo a PCR tubo (s) contendo 25μl de proteinase K. 20mg/ml Incubar a 55 ° C por 4 horas seguido por 10 minutos a 94 ° C e realizar PCR.

5. Resultados representativos

Figura 2. Posição Exemplo de um embrião agarose-embedded. Anterior é mostrado à direita e vista é dorsal. Painel B: células endoteliais pode ser visto em ambos os lados do corpo do embrião e são rotulados com GFP conduzido pelo promotor fli.

Figura 3. Imagens de pós-transplante de embriões. A imagem mostra um embrião de doador e receptor imediato pós-transplante. O embrião doador é mostrado à direita com uma blastoderma completamente vermelho (seta). O embrião destinatário é mostrado do lado esquerdo e é facilmente identificado pela pequena massa de células transplantadas vermelho visível no blastoderma (seta). Imagem B mostra dois embriões destinatário aproximadamente 7 horas pós-transplante (incubados a 27 ° C). Observe as células transplantadas migraram do local de transplante e estão agora dispersos por todo o blastoderma (setas). Imagem C mostra um embrião destinatário, E-29 (aproximadamente 74hpf). Observe a pigmentação no olho ea presença de melanóforos na região do tronco e cérebro (setas). As células-rodamina rotulado pode ser visto para ser colonizar muitas das estruturas embrionárias indicando o sucesso da produção de uma quimera.

Discussion

Neste vídeo demonstramos como dechorionate e realizar transplanataion celular em embriões medaka. Esta é uma técnica poderosa para a produção de embriões quiméricos para o estudo do gene / proteína de função durante o desenvolvimento, bem como para elucidar a autonomia do gene / proteína em questão. Medaka são um sistema modelo útil vertebrados para esta técnica, devido aos mapas destino bem estabelecida e seus empréstimos a transparência los bem na imagem em tempo real, vivo. O transplante pode ser combinado com microinjeção (como descrito em 'microinjeção de embriões Medaka "o protocolo JOVE de acompanhamento) de modo que o comportamento das células transplantadas podem ser facilmente observadas.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.