Summary
在这里，我们描述了一种非侵入性的双光子显微镜（2P）的方法来研究白细胞在鼠标脚垫的归巢。我们将讨论我们的组织成像中的技术方面的准备，然后步行通过设立执行和数据收集的实验，从最初的典型读者。
Abstract
双光子显微镜（2P）是一种高分辨率的成像技术，已被广泛生物学家适应。 2P显微镜的价值是，它提供了丰富的时空内完整的组织和细胞在活体小鼠行为的信息。白细胞招聘中起着重要的作用在宿主防御感染和未选中时，可以促进炎症和自身免疫性疾病。研究在体内的白细胞招聘是在技术上具有挑战性，因为细胞正在迅速在位于深内光散射组织的船只。迄今为止，大多数活体成像研究需要手术的准备，暴露的血管和组织。为了避免手术本身引起的组织损伤和炎症，在这里，我们描述了一种非侵入性的单细胞成像的方法，可用于研究白细胞贩运鼠标脚垫和指骨。我们讨论了我们的2P成像准备的技术方面和读者穿行典型的从最初的成立，以执行和数据采集的实验。
Protocol
1。动物的准备：
这个协议采用成年雌性成年LysM - EGFP小鼠，其中中性粒细胞和巨噬细胞的荧光标记1 EGFP的表达。
- 血管标签：
为了形象化血管，非针对性的量子点15μl（655nm）稀释成100μL的PBS和鼠标前成像10-30分钟静脉注射注入。 - 麻醉：
- 将鼠标在兽医吸入麻醉诱导系统（贵族医疗服务，INC）室。
- 将蒸发器，以3-4％的异氟醚和100％的氧气载气流量，以〜1升/分钟。为了防止意外的麻醉过量，严密监控动物丢失，直到后面的脚趾捏反射。
- 麻醉维持在1.5〜2％异氟醚和罚款，在成像过程中调整，以尽量减少所需的呼吸的文物。仔细鼠标的呼吸频率监测整个成像会议，以保证足够的麻醉平面。
- Puralube兽医美中不足的是适用于眼睛，以防止干燥。
- 鼠标放在一个监管36℃加热垫（布伦特里科学）在注射剂和成像，以防止体温过低。
- 为了防止脱水，鼠标100μL的PBS SC每隔1-2小时。
- 提供一种炎症刺激引起白细胞招聘：
- 鼠标放置在手术阶段，用70％乙醇棉签的脚垫。
- 弯〜90度附近的斜面，以方便注射和提高交货深度的精度胰岛素注射器的针头。
- 装入注射器0.5微克生物粒子在加入1μlPBS稀释的大肠杆菌。这是可以做到在一个离心管中，使其更容易加载液滴的盖子。
- 握住脚趾弯钳和斜角朝上，直到它正下方的皮肤是通过皮肤针轻轻插入。
- 慢慢注入，并保持5秒钟，以防止任何反冲洗。
2。成像阶段设置：
成像平台由划破中心圆孔的铝板。一个大型的玻璃盖粘板和一个橡胶O形圈顶部粘创建流体紧凹室，以适应后足跖底部。铝板加热到36℃通过两个加热板顶部的元素。
- 广场上的预热成像阶段的鼠标和保持鼠标的核心体温，用36℃的气候变暖垫。
- 安全的爪子成像室用的强力胶薄膜的玻璃罩。
- 洗净爪子两次删除任何胶水浮动位，然后用新鲜PBS（预热至36℃）填写室。
小鼠可长达4小时的成像不包括动物的生存能力。脚可以轻轻地释放少量的丙酮和纵向成像研究恢复小鼠。然而，在这种情况下，我们建议成像期<2小时，等待会话之间的24-48 h内尽量减少麻醉过量或脱水的危险。
3。影像采集
双光子显微镜（2P显微镜）在本议定书中使用一个定制的双激光系统，包括视频率一个堂堂正正的显微镜。该系统配有两个钛蓝宝石激光器，四头同时3日和4通道的收购和20倍水浸泡的目的（奥林巴斯，20x/0.95 NA）的双碱光电倍增管。
- 变色龙XR掺钛蓝宝石激光器（相干公司）调整为890 - 900nm。
- 使用480nm和560nm分色镜（SemRoc）三个渠道：蓝色（<480纳米，二次谐波产生的信号），绿（480 - 560nm，LysM - EGFP阳性的中性粒细胞）和红色（> 560 nm的量子点标记的血管分开）。另外，与570nm处的过滤器来区分大肠杆菌560nm过滤器可更换大肠杆菌生物粒子（576nm生物粒子，会出现橙色）从655nm量子点（会出现深红色） 。
- 小心地进入PBS的目标和重点放在脚趾的船只。
- 随着视频率（30f/sec）的图像采集速度运行，并使用由胶原蛋白所产生的二次谐波信号作为一个组织具有里程碑意义的，迅速调查的组织（视频速率采集速度）找到一个利益的血管（一可见lysM - EGFP中性粒细胞）。
- 光电倍增管的增益调整优化分色，并尽量减少需要足够的信号，以实现对背景的激光量（BE注意不饱和的形象！）。
- 一旦面积地区的利益所在，开始时间推移成像。时间的推移，可以执行两个不同的时间分辨率成像。成像细胞滚动和粘附在血管内实时，我们获得30f/sec在一个单一的z平面。我们记录于薄壁细胞外渗及迁移执行3D的成像时间推移。一个典型的收购协议将包括为每个Z步平均15帧，收购量200-22550μm的Z -步骤为21 30秒的间隔连续2.5μm。
- 一旦实验室的服务器上存储的数据文件，Imaris或Volocity软件可用于执行多维的渲染和细胞跟踪2，3 。
4。代表性的成果
滚动沿着船只在200X 1.Real时间（30f/sec）中性粒细胞的想像。时间的推移成像显示中性粒细胞，在绿色中，约10分钟，以红色显示，李斯特菌感染后沿血管内皮滚动。结缔组织中的胶原纤维呈蓝色。请点击这里看视频。
2.Time推移三维成像在200X的中性粒细胞的招聘动态。典型的中性粒细胞招聘是从流通，并通过炎症组织迁移所示，请点击这里看视频 。
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Discussion
在此视频协议中，我们展示了在炎症反应中白细胞招聘2P非侵入性成像程序。
脚垫是一个经典的研究，如过敏，感染和自身免疫性疾病4-7发炎的生理网站。 2P的成像提供了一个详细的图片，滚动和粘附在血管效应功能的网站趋化白细胞贩运途径不同的步骤。我们发现，针对不同类型的炎症刺激白细胞招聘的变化。刺激的剂量应慎重选择，每次尝试复述一种生理性的侮辱。如果剂量过高或交付给一个非生理性的网站，刺激可能压倒主机或导致实验文物，并产生异常现象。我们建议搭配一个合适的控制和使用弯针，以增加交付量和注射深度的精度试点实验的滴定剂量的刺激。同样至关重要的是，注射部位可以很容易地位于的，尤其是对序列成像实验。这可以通过在一个特定的位置（即第三趾的右后爪第二位数）注射或纹身的皮肤和注射附近。
2P成像提供了一个独特的机会， 在体内的白细胞贩运和效应功能可视化。大多数活体成像的方法用来研究白细胞招聘要求揭露麻醉小鼠在 8-10的组织和血管的手术。手术本身引起的炎症会影响白细胞的行为。然而，2P成像允许白细胞进行研究非侵入性的和深的单细胞内的原生3D组织环境的决议。此外，自成像过程中，本身不损害鼠标，这是一个很好的选择，癌症和关节炎模型的纵向研究。 2P成像有潜力提供前所未有的观点，从疾病的启动和进展的疾病过程号决议，在所有动物个体主体。这种方法是一个有价值的工具，获得洞察到细胞和分子机制，感染的细胞免疫和如何这些相同的反应，如果监管不当，可能会导致炎症和自身免疫性疾病的基础。最终， 在体内的白细胞行为的详细情况将在用于治疗炎症和传染性疾病的新疗法的发展援助。
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Disclosures
所有实验均在圣路易斯华盛顿大学的动物研究委员会批准的协议。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予R01 - 3155 - 53502和华盛顿大学辉瑞生物医学研究协议的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A.
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C.
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
