Summary
Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie Ansatz zur Untersuchung Leukozyten homing in der Maus Fußballen. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer Tissue Imaging Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.
Abstract
Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie ist eine hochauflösende bildgebende Verfahren, die im Großen und Ganzen wurde von Biologen angepasst. Der Wert der 2P-Mikroskopie ist, dass es reiche raumzeitlichen Informationen über Zell Verhaltensweisen innerhalb intakte Gewebe und in lebenden Mäusen liefert. Rekrutierung von Leukozyten spielt eine bedeutende Rolle in Immunabwehr gegen Infektionen und wenn deaktiviert, kann zu entzündlichen und Autoimmun-Erkrankungen beitragen. Studieren Leukozytenrekrutierung in vivo ist technisch anspruchsvoll, da die Zellen schneller sind, die innerhalb Schiffe tief im Lichtstreuung Gewebe entfernt. Bis heute verlangen die meisten intravital bildgebende chirurgische Vorbereitung auf die Blutgefäße und Gewebe freizulegen. Um zu vermeiden, die Gewebeschäden und Entzündungen, die durch Operation selbst induziert, hier beschreiben wir eine nicht-invasive Single-Cell-Imaging-Ansatz, mit dem Leukozyten-Handel mit der Maus Fußballen und Phalangen Studie werden können. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer 2P Bildgebung Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.
Protocol
1. Tierische Zubereitung:
Dieses Protokoll verwendet erwachsenen weiblichen erwachsenen LysM-eGFP Mäusen, bei denen Neutrophilen und Makrophagen fluoreszierend sind durch die Expression von eGFP 1 bezeichnet.
- Labeling Blutgefäße:
Zur Visualisierung Blutgefäße, 15μl von nicht gezielten Quantenpunkte (655nm) werden in 100 ul PBS verdünnt und intravenös in die Maus 10-30 min vor Imaging injiziert. - Anästhesie:
- Platzieren Sie die Maus in die Induktion Kammer des Veterinär-Inhalationsnarkose System (Noble Medical Service, Inc).
- Setzen Sie den Verdampfer auf 3-4% Isofluran und 100% Sauerstoff Gasstrom auf ~ 1 L / min. Um Fehlbedienungen zu vermeiden Anästhesie Überdosierung genau beobachten das Tier bis zum hinteren Fuß Prise Reflex ist verloren.
- Anästhesie ist bei 1,5 gehalten ~ 2% Isofluran und feine während der Bildgebung abgestimmt, um die Atmung Artefakte wie nötig zu minimieren. Die Atemfrequenz der Maus ist sorgfältig in der Imaging-Session überwacht, um eine angemessene Ebene der Narkose zu versichern.
- Puralube Veterinär Salbe ist für die Augen, um zu verhindern Trocknung angewendet.
- Die Maus ist an einem geregelten 36 aufgesetzt ° C Heizkissen (Braintree Scientific) während der Injektionen und Bildbearbeitung, um eine Unterkühlung zu verhindern.
- Um zu verhindern, Dehydratation, ist die Maus 100 ul PBS sc alle 1-2 Stunden gegeben.
- Delivering eine entzündliche Reize zu Leukozytenrekrutierung induzieren:
- Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Bühne und Tupfer der Fußsohle mit 70% Ethanol.
- Biegen Sie die Nadel einer Insulin-Spritze ~ 90 Grad in der Nähe der Schräge der Injektion zu erleichtern und verbessern die Genauigkeit der Lieferung Tiefe.
- Legen Sie die Spritze mit 0,5 ug E.coli Biopartikeln in 1μl PBS verdünnt. Dies kann in den Deckel eines Mikrozentrifugenröhrchen zu erleichtern, um den Tropfen Last durchgeführt werden.
- Halten Sie den Fuß mit einer gebogenen Pinzette und führen Sie die Nadel vorsichtig durch die Haut mit der Fase nach oben, bis sie knapp unter der Haut ist.
- Injizieren Sie langsam und halten Sie ihn 5 Sekunden lang zu verhindern, dass wieder spülen.
2. Imaging Bühnenaufbau:
Die Imaging-Plattform besteht aus einer Aluminium-Platte mit einem kreisrunden Loch in der Mitte abgeschnitten. Ein großes Deckglas wird an der Unterseite der Platte und ein Gummi-O-Ring ist an der Oberseite geklebt, um eine flüssigkeitsdichte vertiefte Kammer zu schaffen, um die Hinterpfote Platz geklebt. Die Aluminiumplatte wird auf 36 ° C über zwei Heizelemente an der Oberseite der Platte erwärmt.
- Legen Sie die Maus auf den vorgewärmten Bildgebung Bühne und halten Sie die Maustaste ist die Kerntemperatur des Körpers mit dem 36 ° C Erwärmung pad.
- Sichern Sie die Pfote an den Deckglas des abbildenden Kammer mit einer dünnen Schicht von Sekundenkleber.
- Waschen Sie die Pfote zweimal, um eine schwimmende Bits Kleber zu entfernen und füllen Sie dann die Kammer mit frischem PBS (bis 36 vorgewärmten ° C).
Mäuse können für bis zu 4 Stunden ohne aus dem Tier die Lebensfähigkeit abgebildet werden. Der Fuß kann leicht mit wenig Aceton und Mäuse für die Längs-Imaging-Studien wieder freigegeben werden. Allerdings ist in diesem Fall empfehlen wir die Bildgebung Zeitraum bis <2 Stunden und wartet 24-48 h zwischen den Sitzungen, um das Risiko der Narkose Überdosierung oder Austrocknung zu minimieren.
3. Imaging Acquisition
Die Zwei-Photonen-Mikroskop (2P-Mikroskop) im Sinne dieses Protokolls ist eine custom-built Dual-Laser-Video-Rate-System bestehend aus einem aufrechten Mikroskop. Das System ist mit zwei Ti ausgestattet: Sapphire Laser, vier Haupt-on Bi-Alkali-PMTs für das simultane 3 und 4-Kanal-Akquisitionen und ein 20x Wasserimmersionsobjektiv (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Tune the Chameleon XR Ti: Saphir-Laser (Coherent Inc.), um 890-900nm.
- Verwenden 480nm und 560nm dichroitische Spiegel (SemRoc) zu drei Kanäle trennen: blau (<480 nm, Second Harmonic Generation-Signal), Grün (480-560nm, LysM-eGFP positiven Neutrophilen) und Rot (> 560 nm, Quantenpunkt bezeichnet Blutgefäße ). Alternativ kann die 560nm-Filter mit einem 570nm Filter E. unterscheiden ersetzt werden coli Biopartikeln (576nm Biopartikeln erscheint orange) von 655nm Quantenpunkte (erscheint tiefrot).
- Vorsichtig das Ziel in die PBS und konzentrieren sich auf ein Schiff der Zehe.
- Mit der Aufnahmegeschwindigkeit, die bei Video-Rate (30f/sec) und mit der zweiten harmonischen Signals ausgehend von Kollagen als ein Gewebe Wahrzeichen, schnell Umfrage des Gewebes (bei Video-rate Aufnahmegeschwindigkeit), um ein Blutgefäß von Interesse (eine lokalisieren mit sichtbaren lysM-eGFP Neutrophile).
- Stellen Sie den Gain auf der PMTs einer Farbtrennung zu optimieren und die Höhe der Laser benötigt, um ein ausreichendes Signal gegenüber dem Hintergrund zu erreichen (werdenAchten Sie darauf, um das Bild zu sättigen!).
- Sobald Flächenbereich der Interessen befindet, beginnen Zeitraffer-Bildgebung. Zeitraffer-Imaging kann mit zwei verschiedenen zeitlichen Auflösungen durchgeführt werden. Für die Bildgebung Zellrollen und Adhäsion und in Echtzeit innerhalb von Blutgefäßen, so erwerben wir 30f/sec an einem z-Ebene. Zur Dokumentation Zelle Extravasation und Migration in das Parenchym führen wir 3D Zeitraffer-Bildgebung. Ein typisches Übernahme-Protokoll wird von durchschnittlich 15 Frames pro Z-Schritt und den Erwerb von 21 aufeinanderfolgenden 2.5μm z-Schritte mit einem Volumen von 200-225 50 um bei 30 Sekunden-Intervallen bestehen.
- Sobald die Daten-Dateien auf dem Labor-Server gespeichert sind, können Imaris oder Volocity Software verwendet, um multi-dimensionale Darstellung und Zell-Tracking 2, 3 durchzuführen.
4. Repräsentative Ergebnisse
1.Real-Zeit (30f/sec) vorstellen, der neutrophilen Rollen entlang der Gefäße bei 200x. Zeitraffer-Aufnahme zeigt Neutrophilen, in grün, Rollen entlang des Endothels der Blutgefäße etwa 10 Minuten nach der Infektion mit Listeria monocytogenes, in rot dargestellt. Kollagenfasern im Bindegewebe erscheinen in blau. Bitte klicken Sie hier, um das Video zu sehen.
2.Time Zeitraffer 3D-Bildgebung von neutrophilen Rekrutierung Dynamik bei 200x. Typische neutrophilen Rekrutierung aus dem Verkehr und Migration durch entzündetes Gewebe wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um das Video zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Video zeigen wir, Protokoll der Verfahren für nicht-invasive Bildgebung von 2P Leukozytenrekrutierung in Reaktion auf Entzündungen.
Die Fußsohle ist ein klassisches physiologischen Ort für das Studium Entzündungen wie Allergien, Infektionen und Autoimmunerkrankungen 4-7. 2P Bildgebung liefert ein detailliertes Bild über verschiedene Schritte in Leukozyten Menschenhandel Wege, von Walz-und Haftung in den Blutgefäßen die Chemotaxis zu den Orten der Effektor-Funktion. Wir haben festgestellt, dass die Rekrutierung von Leukozyten in Reaktion auf verschiedene Arten von entzündlichen Stimuli variiert. Die Dosis des Stimulus sollte sorgfältig ausgewählt werden und jeder Versuch unternommen werden, um eine physiologische Beleidigung zu rekapitulieren. Wenn die Dosis zu hoch ist, oder an einen nicht-physiologischen Seite, könnte der Reiz überwältigen den Host oder zu experimentellen Artefakten und produzieren abnorme Phänomene. Wir empfehlen die titrierte Dosen Impulse für Pilotversuche mit einer geeigneten Steuerung gekoppelt und mit einem gebogenen Nadel, die Genauigkeit der sowohl das Volumen geliefert und die Tiefe der Injektion zu erhöhen. Es ist auch entscheidend, dass die Injektionsstelle leicht lokalisiert werden kann, vor allem für die serielle Imaging Experimente. Dies kann durch die Injektion an einer bestimmten Stelle (dh zweite Ziffer auf der dritten Zehe des rechten Hinterpfote) oder durch Tätowierung der Haut und Injizieren der Nähe erreicht werden.
2P Imaging bietet eine einzigartige Gelegenheit für die Leukozyten Menschenhandel und Effektor-Funktion in vivo zu visualisieren. Die Mehrheit der Intravitalmikroskopie bildgebenden Verfahren verwendet, um die Rekrutierung von Leukozyten-Studie eine Operation erforderlich, um Gewebe und Blutgefäße in narkotisierten Mäusen 8-10 aussetzen. Die Operation selbst induziert Entzündung, die Leukozyten-Verhalten auswirken. Allerdings ermöglicht 2P Bildgebung Leukozyten untersucht nicht-invasiv und Single-Cell-Auflösung tief in die native 3D-Gewebe-Umgebung werden. Darüber hinaus, da die bildgebenden Verfahren selbst nicht nachteilig auf die Maus, ist es eine ausgezeichnete Wahl für die Durchführung von Längsschnittstudien für die Modelle von Krebs und Arthritis. 2P Bildgebung hat das Potential für die Bereitstellung und umfassenden Überblick über eine Krankheit Prozess von der Krankheit Initiation und Progression, um die Auflösung, die alle innerhalb eines einzelnen Tieres unterliegt. Dieser Ansatz ist ein wertvolles Werkzeug für den Erhalt Einblick in die zellulären und molekularen Mechanismen, die zelluläre Immunität gegen Infektionen und wie diese gleichen Reaktionen, wenn sie falsch reguliert, kann zu entzündlichen und Autoimmun-Erkrankungen führen zu Grunde liegen. Letztendlich wird ein detailliertes Bild der Leukozyten-Verhalten in vivo Hilfe bei der Entwicklung neuer Therapeutika zur Behandlung von entzündlichen und infektiösen Krankheiten sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle Experimente wurden nach Protokollen von der Animal Studies Ausschuss der Washington University in St. Louis genehmigt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH R01-3155 bis 53.502 und Washington University-Pfizer Biomedical Research Agreement unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A.
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C.
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
