Summary
ここで、我々は、マウスの足蹠にホーミング白血球を研究する非侵襲的二光子（2P）顕微鏡のアプローチを説明します。私たちは、組織イメージングの準備の技術的側面を議論し、実行してデータ収集するための初期設定から典型的な実験を通してリーダーを歩く。
Abstract
二光子（2P）顕微鏡は、広く生物学者によって適応された高分解能のイメージング技術です。 2P顕微鏡の値は、それがそのまま組織内および生きたマウスの細胞の挙動に関する豊富な時空間情報を提供することです。白血球の動員が感染し、このチェックボックスをオフにした場合に対する宿主防御において重要な役割を果たし、炎症や自己免疫疾患に貢献することができます。細胞は光散乱の組織内に深くある血管内に急速に移動しているので、 生体内で白血球動員を研究することは技術的に困難である。これまでに、ほとんどの生体内イメージング研究では、血管や組織を露出させる手術の準備が必要です。手術自体によって誘導される組織の損傷や炎症を避けるために、ここで、我々は、マウスの足蹠とphalanxの複数形で白血球人身売買を研究するために使用できる非侵襲的単一細胞イメージングのアプローチを説明します。私たちは、2Pのイメージングの準備の技術的側面を議論し、実行してデータ収集するための初期設定から典型的な実験を通してリーダーを歩く。
Protocol
1。動物の準備：
このプロトコルは、好中球とマクロファージを蛍光eGFPの1の発現によってラベル付けされている、大人の女性の成人LysM - EGFPマウスを使用しています。
- 血管のラベリング。
血管を可視化するために、非標的量子ドット（655nm）の15μlのPBSを100μlに希釈し、イメージを作成する前に、マウス10〜30分間に静脈内注射されています。 - 麻酔：
- 獣医吸入麻酔システム（ノーブルメディカルサービス株式会社）の誘導チャンバ内にマウスを置きます。
- イソフルラン3から4パーセントと約1リットル/ min〜100％の酸素をキャリアガスの流量に気化器を設定します。リアのトーインのピンチの反射が失われるまでの偶発的な麻酔の過剰摂取を防ぐために、密接に動物を監視する。
- 麻酔は1.5に維持され、必要に応じて呼吸のアーチファクトを最小限に抑えるために撮像中にチューニングさ〜2％イソフルランおよび罰金。マウスの呼吸数は、麻酔の適切な面を保証するために、イメージングセッション全体を通じて慎重に監視されます。
- Puralube獣医軟膏は乾燥を防ぐために目に適用されます。
- マウスは注射とイメージングの間に規制さ36 ° C加熱パッド（ブレーントリーサイエンティフィック）上に配置され、低体温を防止する。
- 脱水を防ぐために、マウスは、PBS SC毎に1〜2時間の100μlを与えられます。
- 白血球動員を誘導する炎症性刺激を提供：
- 手術の段階と綿棒を70％エタノールで足蹠にマウスを置きます。
- 〜90度の注入を容易にし、配信の深さの精度を向上させるためにベベルの近くにインスリン注射器の針を曲げます。
- 1μlのPBSで希釈した大腸菌の生体粒子の0.5μgのでシリンジをロードする。これは、それが容易に液滴をロードするためにマイクロチューブの蓋で行うことができます。
- 湾曲鉗子でつま先を持ち、それが皮膚のすぐ下になるまで、ベベルを上に向けた状態で、皮膚を通して優しく針を挿入する。
- ゆっくり注入してバックフラッシュいずれかを防ぐために5秒間の場所に保持する。
2。イメージングの段階のセットアップ：
イメージングプラットフォームでは、センターカットスルー円形の孔を有するアルミ板で構成されています。大規模なカバーガラスは、板の底部に接着されており、ゴム製O -リングは、後部足を収容する液密埋め込み式チャンバーを作成する上に接着される。アルミ板を36℃までプレートの上部に取り付けられている2つの加熱エレメントを経由して加温する。
- 予め温めておいた画像のステージ上でマウスを置き、36℃の温暖化のパッドを使用してマウスの中核体温を維持する。
- 瞬間接着剤の薄膜を持つイメージングチャンバーのカバーガラスに足を固定します。
- 接着剤のいずれかの浮動小数点のビットを削除してから（36 ° Cに予め温めておいた）新鮮なPBSで容器を埋めるために二度足を洗ってください。
マウスは、動物の生存能力を構成することなく、4時間まで撮像することができます。足を穏やかにアセトン及び長手方向のイメージング研究のために復活したマウスの少量でリリースすることができます。ただし、この場合には、私たちは<2時間にイメージング期間を推奨し、麻酔の過剰摂取や脱水の危険性を最小限にするためにセッション間で24〜48時間を待っている。
3。イメージング買収
このプロトコルで使用される2つの光子顕微鏡（2Pの顕微鏡では）正立顕微鏡を構成される特注のデュアルレーザーのビデオレートシステムです。サファイアレーザー、4つのヘッドオン3つの同時および4チャネルの買収と20倍の水浸対物レンズ（オリンパス、20x/0.95 NA）のためのBi -アルカリ光電子増倍管：システムは2つのTiが装備されています。
- 890 - 900nmのにサファイアレーザー（コヒーレント株式会社）：カメレオンXR Tiをチューニングします。
- 青（<480nmの、第二高調波発生の信号）、緑（480 - 560nm、LysM - EGFP正好中球）と赤色（> 560nmの、量子ドット標識された血管：3つのチャネルを分離するために480nmと560nmのダイクロイックミラー（SemRoc）を使用してください）。また、560nmフィルターを大腸菌を区別するために570nmのフィルタに置き換えることができます。 655nm量子ドット（赤深い表示されます）から大腸菌の生体粒子（576nm生体粒子がオレンジ色に表示されます）。
- 慎重にPBSに目標を下げて、つま先の容器に焦点を当てる。
- 画像取得速度のビデオレート（30f/sec）で動作し、組織のランドマークとして、迅速に関心の血管（いずれかを見つけるために（ビデオレートの取り込み速度で）組織を調査コラーゲンから発せられる第二高調波信号を使用してある目に見えるlysM - EGFPの好中球で）。
- （となる色の分離を最適化し、背景の上に十分な信号を達成するために必要なレーザーの量を最小限に抑えるために光電子増倍管のゲインを調整します。画像を！）飽和しないように注意してください。
- 興味の領域の領域が特定されると、タイムラプスイメージングを開始する。タイムラプスイメージングは、2つの異なる時間分解能で行うことができます。イメージング細胞のローリングと接着のために、リアルタイムでの血管内で、我々は、単一のz -平面で30f/secを取得する。実質の細胞外漏出や移行を文書化するための我々は3Dタイムラプスイメージングを行う。典型的な買収のプロトコルは、それぞれのZ -ステップのために15フレームを平均して30秒間隔でZ -ステップ200から22550μmの体積は21シーケンシャル2.5μmの取得で構成されます。
- データファイルは、ラボのサーバ上に格納されると、ImarisまたはVolocityソフトウェアは2、3を追跡多次元レンダリングとセルを実行するために使用することができます。
4。代表的な結果
好中球の想像1.Real時間（30f/sec）は200倍で血管に沿ってローリング。タイムラプスイメージングは、赤で示さリステリア菌感染後10分、約血管の内皮細胞に沿って転がり、緑で、好中球を示しています。結合組織のコラーゲン線維は青色で表示されます。 ビデオを見るにはここをクリックしてください。
200Xでの好中球動員のダイナミクスの2.Time経過3Dイメージング。炎症組織を介して循環し、移行の典型的な好中球の動員が表示されます。 ビデオを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
このビデオプロトコルでは、炎症に反応して白血球の動員の非侵襲的な2Pイメージングのための手順を示しています。
足蹠はアレルギー、感染症や自己免疫疾患の4から7のような炎症を研究するための古典的な生理学的なサイトです。 2Pイメージングは、血管のローリングと接着のエフェクター機能のサイトへの走化性に、白血球人身売買経路の明確な手順の詳細な画像を提供します。我々は、白血球の動員は、炎症性刺激の異なる種類に対応して変化することを発見した。刺激の投与量を注意深く選択し、すべての試みは生理学的な侮辱を再現するためになされるべきである。投与量が高すぎたり、非生理的なサイトに配信される場合、刺激は実験的なアーティファクトにホストまたはリードを圧倒し、異常な現象が生じる可能性があります。我々は、適切なコントロールと対にして配信量と注入の深さの両方の精度を高めるために曲がった針を用いてパイロット実験のための刺激の漸増用量をお勧めします。それは、特にシリアルイメージング実験のために、また、注射部位を容易に配置できることが重要です。これは、（すなわち、右後肢の第3趾の2番目の桁）の特定の場所に注入することにより、または皮膚を刺青し、近くに注入することによって行うことができます。
2Pイメージングは、白血球の人身売買とin vivoでのエフェクター機能を視覚化するユニークな機会を提供します。生体内イメージングの大半は、麻酔したマウスの8-10に組織と血管を露出させる手術を必要とする白血球の動員を研究するために使用近づく。手術自体は、白血球の動作に影響を与える炎症を誘発する。しかし、2Pイメージングは、白血球が非侵襲的かつネイティブ3D組織の環境内での深いシングルセルの解像度で勉強することができます。イメージング手順自体はマウスに影響がでないので、さらに、、それは癌や関節炎のモデルのために長期的な研究を行うための優れた選択肢です。 2Pイメージングは、解像度、個々の動物検体内のすべてに提供し、疾病の発生や進行の病気のプロセスの前例のないビュー可能性を秘めています。このアプローチは、感染方法と、これらは同じ応答する細胞性免疫の根底にある細胞および分子メカニズムへの洞察を得るための貴重なツールですが不適切に調節した場合、炎症や自己免疫疾患につながる可能性があります。最終的に、 生体内で白血球挙動の詳細な画像は、炎症や感染症を治療するための新しい治療法の開発の援助になります。
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Disclosures
全ての実験は、セントルイスのワシントン大学の動物研究委員会で承認されたプロトコールに従って実施した。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成R01 - 3155から53502とワシントン大学、ファイザー医学の研究契約によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
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