Summary
لقد أصبح من الكميات فواصل المزدوج حبلا الحمض النووي على أساس من بؤر γH2AX أداة لا تقدر بثمن ، لا سيما في مجال البيولوجيا الإشعاعية ، لتقييم حساسية للأشعة الأنسجة وآثار الاشعاع تعديل المركبات. نحن هنا لشرح استخدام للمقايسة التألق المناعي عن الكميات من بؤر γH2AX في عينات الأنسجة.
Abstract
الحمض النووي مزدوج الجديلة (DSBs) هي آفات فتاكة بشكل خاص وسام للجينات ، التي يمكن أن تنشأ إما عن طريق عمليات داخلية (فسيولوجية أو مرضية) أو بفعل عوامل خارجية ، وخاصة الإشعاعات المؤينة والمركبات محاك للإشعاع. الفسفرة من البديل H2A هيستون ، H2AX ، على بقايا سيرين 139 ، في غاية الحفظ عزر SQEY C - المحطة ، وتشكيل γH2AX ، هو الاستجابة المبكرة لالحمض النووي المزدوج الجديلة
Protocol
الأنسجة
- كان نسيج الرئة ، وجزءا لا يتجزأ من قوالب القطع في درجة الحرارة المثلى (أكتوبر) 4583 مركب ، مقطوع (5 ميكرون) باستخدام CM ايكا 1950 ناظم البرد والتي شنت على بولي - L - يسين الشرائح.
تم الحصول على عينات مجمدة من الدكتور سيمون رويس في معهد أبحاث الطفولة مردوخ. تم الحصول على أنسجة الرئة من دون علاج BALB / ج الفئران والفأر نموذج من مرض مزمن في الشعب الهوائية من الحساسية مما يدل على العديد من الميزات مرضي الربو الإنسان 6. وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها لجنة أخلاقيات الحيوان من معهد بحوث الأطفال مردوخ التي تلتزم القانون الاسترالي ممارسات لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لأغراض علمية.
- وسمح للأقسام الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
المناعي تلطيخ
- تم إصلاح الأجزاء مع 2 ٪ (W / V) في بارافورمالدهيد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 20 دقيقة.
- وكانت المقاطع المتوازنة مع اثنين من يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- وعولج المقاطع مع الايثانول 70 ٪ (مبردة إلى -20 درجة مئوية) لمدة 20 دقائق تليها ثلاث غسلات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
عند هذه النقطة قد تكون مخزنة في حاويات مختومة الشرائح في 4 درجة مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع.
- تم غسلها ثلاث مرات مع المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة كل وسدت ثم مع 100μL الطازجة التي تحتوي على جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني في برنامج تلفزيوني 8 ٪ التي تحتوي على 0.5 ٪ توين - 20 و 0.1 ٪ تريتون X - 100 (PBS - TT) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة .
وأجريت جميع حضانات في حوض تلطيخ مرطب. - وكانت تغسل مع أقسام PBS - TT لمدة 5 دقائق ، وتميزت محيط مسعور حول الأنسجة بالقلم عنق الرحم.
- وكان من المتوقع العازلة الزائد و100μl الأولية الأضداد المضادة للأرنب γH2AX النسائل المتعددة (مخفف 1:500 ، في جيش صرب البوسنة 1 ٪ في برنامج تلفزيوني ؛ ميليبور) ، وأضيف إلى كل قسم لحضانة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ويمكن تنفيذ الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
لمزيد من الأدلة ، التي تمثل بؤر γH2AX DSBs ، قد أيضا الضد الابتدائي الاعتراف إصلاح DSB البروتين يمكن استخدامها. على سبيل المثال ، شارك في توطين γH2AX الفوسفات وأجهزة الصراف الآلي ، هو مزيج شائع الاستخدام. - وجرفت المياه المقاطع مرتين في برنامج تلفزيوني - TT لمدة 5 دقائق لكل وحضنت مع 100μl من الأجسام المضادة الثانوية (488 فلور اليكسا الماعز المضادة للأرنب مفتش المخفف 1:500 ، في جيش صرب البوسنة 1 ٪ ؛ Invitrogen) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام . (كان يحتفظ الضد المخففة في الظلام طوال الداخلي).
- تم غسلها ثلاث مرات مع أقسام PBS - TT لمدة 5 دقائق لكل وحضنت مع 0.5mg/mL ريبونوكلياز A لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تم تنفيذ النووية counterstaining والمتصاعد مع المتوسط تحتوي على يوديد Vectashield propidium.
- تم اغلاق الشرائح مع طلاء الأظافر وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام قبل التحليل.
المجهري / تحليل
- واستخدمت ميتا LSM510 زايس مجهر متحد البؤر إلى الحصول على صور باستخدام GFP القياسية (لγH2AX -- اليكسا 488 فلور الماعز المضادة للأرنب مفتش) وPI (543 نانومتر) ليزر.
تم الحصول على الصور في نمط Z - سلسلة مع حجم الخطوة من 0.5 ميكرون. أثناء التحليل ، وكانت طائرات deconvoluted الفردية ومكدسة لإنتاج صورة الأقصى المتوقع للحد من تداخل البؤر.
يجب فقط طريقة لخلق صورة القصوى المتوقعة قبل العد الجسيمات يمكن استخدامها في الظروف حيث يتم استخدام قسم رقيقة (مثل 5μm) ، وفيها تلوين الخلفية غير ذات أهمية. حيث يجب تحليل المقاطع سمكا مع خلفية كبيرة ، يجب استخدام تحليل أكثر تعقيدا مثل مكافحة كائن 3D كما وصفها وBolte Cordelieres (2006) 7.
- وقد استخدم Metamorph (الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية) لإنشاء المدمجة (الأحمر والأخضر) لوحات لعدد من البؤر quantitate.
وإن كان يمكن استخدامه لMetamorph quantitate أعداد البؤر ، عندما تستخدم عادة أقسام الأنسجة تحسب بؤر يدويا (بالعين) لمزيد من الدقة.
يمكن تحديد أنواع معينة من الخلايا التي تهم الكميات ، على سبيل المثال طلائي خلايا الرئة. ويمكن أن يتم على أساس هذه الأنسجة ، وبالإشارة إلى المقاطع haematoxylin يوزين والمسلسل الملون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لغرض هذه المظاهرة كنا الماوس أنسجة الرئة من دون علاج BALB / ج والفئران من نموذج الفأر من مرض مزمن في الشعب الهوائية التحسسي. quantitated نحن اختلافات في عدد من البؤر في زنزانة مع المعدلات أعلى قليلا لوحظت في الرئة مقارنة المقاطع التالفة دون علاج. على وجه التحديد ، أشار الكميات 6.5 في بؤر / الخلية و 9.4 في بؤر / خلية (العد اليدوي لل20 زنزانة في القسم) ، في الأنسجة وعلاج الأمراض المزمنة حساسية الشعب الهوائية الأنسجة ، على التوالي. ومع ذلك ، فإن استخدام عامل DSB الذي يحفز لالنفثالين سبيل المثال ، والذي يعرف للحث على DSBs في نموذج الفأر الرئة ، والغلة أعلى الأرقام البؤر. في الواقع ، وهذا البروتوكول هو الأكثر ملاءمة للتحقيق في آثار الإشعاع المؤين في الأنسجة ، ويتم الحصول على نتائج أكثر إثارة للانتباه ، من حيث عدد البؤر γH2AX والقرار عند استخدام الأشعة المؤينة. ومن المعروف جيدا أن التعرض لأشعة التالية - X ، γH2AX شكل بؤر بؤر الأرقام بسرعة والتوصل إلى الحد الأقصى ما بين 30-60 دقيقة 2. لذا ، 1 النقاط الزمنية ساعة (بعد التشعيع) مثالية لتقييم أولي تشكيل جهاز تسوية المنازعات وأوقات أطول (عادة ما يصل إلى 48 ساعة) يمكن استخدامها لرصد إصلاح الحمض النووي.
عموما ، من الكميات γH2AX في الأنسجة غير مفيدة لرصد تشكيل جهاز تسوية المنازعات وإصلاح. وبصرف النظر عن فائدته في سياق الإشعاعات المؤينة ، ويمكن تطبيق أسلوب لتقييم فعالية DSB - حمل المركبات في الأنسجة المختلفة ، على سبيل المثال من المعروف أن anthracyclines شيوعا المضادة للسرطان مثل دوكسوروبيسين تسبب DSBs ، ورصد يحتمل أن الأمراض المختلفة التي تتميز بها رد الفعل DSBs الأنواع بوساطة الأوكسجين. الأهم ، وهذا البروتوكول هو مناسبة للأنسجة الماوس مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ومن المسلم به بدعم من المعهد الأسترالي للعلوم والهندسة النووية. وكان TCK المستلم من الجوائز AINSE. يتم اعتماد مختبر الطب التي Epigenomic الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (566559). ويدعم LM عن طريق البحث في ملبورن (جامعة ملبورن) والمنح الطبية التكميلية لجنة حقوق الطفل التصوير. وبدعم من جامعة موناش مايكرو التصوير (الدكاترة ستيفن كودي وكارمايكل Iśka) لا تقدر بثمن لهذا العمل. MMT تشعر بالامتنان للمساعدة والمشورة من الخبراء الدكتورة أولغا Sedelnikova من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
