Summary
IP FCM的方法是，允许一个敏感的，健壮的，原生的蛋白质 - 蛋白质相互作用的生化评估，而无需遗传工程或大样本。
Abstract
通过流式细胞仪检测免疫沉淀（IP，FCM）是一种用于检测和定量蛋白质相互作用的有效方法。基本原则延伸夹心ELISA法，其中捕获的主要分析物可以检测到身体内多蛋白复合物相关的其他分子一起。该过程涉及与immunoprecipitating单克隆抗体（mAb）的具体利益的蛋白质，细胞裂解液中培育这些珠子，捕获的蛋白复合物与荧光标记的探针探测，并通过流式细胞仪分析珠相关的荧光聚苯乙烯乳胶微球的共价偶联。 IP - FCM是极其敏感的，允许在本机（非变性）状态的蛋白质分析，并服从或者半定量或定量分析。 IP - FCM需要作为额外的好处，没有基因工程或专门的设备，流式细胞仪以外，它可以很容易地适应高通量应用。
Protocol
**本视频协议是基于相关出版物1：本机的蛋白质相互作用的多蛋白复合物和流式细胞仪的高灵敏度检测和定量分析。亚当G. Schrum，黛安娜吉尔，伊莱恩体育Dopfer，大卫L WIEST，劳伦斯A. Turka，沃尔夫冈西澳Schamel，埃德 - 帕尔默。 STKE 2007年“科学”（389）：PL2，6月5日，2007年，[作者：10.1126/stke.3892007pl2] 请点击这里查看本出版物 。
开始之前，请准备以下的水库存解决方案：
| MES的耦合缓冲： | 储存在25 ° C |
| MES，pH值6.0 | 50毫米 |
| EDTA | 1毫米 |
| 淬火/阻止/存储缓冲区（QBS）： | 保存在4 ° C |
| 牛血清白蛋白 | 1％ |
| 叠氮化钠 | 0.02％ |
| PBS，pH值7.4 | 1X |
| FCM的缓冲区： | 保存在4 ° C |
| 三，pH值7.4 | 50毫米 |
| 氯化钠 | 100毫米 |
| 叠氮化钠 | 0.02％ |
| 胎牛血清 | 5％ |
| PBS，pH值7.4 | 1X |
立即准备使用前：
| EDAC - MES的： | 在MES耦合缓冲液溶解50毫克/毫升EDAC的粉 |
| 毛地黄皂苷溶液（2％W / V）： | 卫生署2 O溶解毛地黄皂苷粉末加热到95℃，5分钟，然后在冰上冷却 |
| 裂解缓冲液： | |
| 三，pH值7.4 | 50毫米 |
| 氯化钠 | 150毫米 |
| 毛地黄皂苷的解决方案 | 1％ |
| 蛋白酶抑制剂 | 1X |
| 置于冰上 |
1。耦合珠单抗
- 从购买股票的确定珠的浓度稀释在PBS和一个hemacytometer计数。 1:10000稀释的珠子开始计数。
- 移液器18 × 10 6到1.5 ml离心管珠。
- 洗磁珠在0.5至1.0毫升MES偶联缓冲2到3倍，在20,000克3分钟，在25 ° C离心后每洗。
- 50μLMES偶联缓冲液重悬珠。
- 加入20μL新鲜配制的EDAC - MES激活的羧基上的珠子。
- 在25 ° C通过手动移液器上下轻轻搅拌15分钟。
- 洗净激活珠2至3倍，在0.5至1.0毫升PBS离心20,000克，3分钟后在25 °每个洗的C。
- 在50μL的PBS重悬激活珠。
- 加入50μL的知识产权人与生物圈计划（股权集中在0.2-1.0毫克/毫升）激活珠的解决方案。
- 3至4小时在25 ° C的混合放在振动筛管。摇到足以防止沉淀在试管底部珠。
- 洗净人与生物圈计划加上珠在0.5至1.0毫升PBS的2至3倍，离心3分钟，在20000克在25 ° C后，每次冲洗。
- 重悬于100缓冲液QBS珠。这些都可以存储在4 ° C
- 暂停的珠子，在PBS稀释1:200-1:10,000与hemacytometer和计数。浓度必须测量每个制备批，可精确控制，使每个IP或下拉实验中使用的珠数。
2。后核裂解液的制备及IP
裂解法和最佳的裂解条件，将取决于细胞类型，并正在研究蛋白质相互作用。的协议存在，并且可以为您的应用程序进行修改。
- 裂解20 × 10 6'小'细胞，如淋巴细胞，或5 × 10 6“大”的细胞，如巨噬细胞或肿瘤细胞，在100μL新鲜的1.5 ml离心管放在冰上20分钟的裂解缓冲。需要规模的溶解量。
- 为了去除细胞核和不溶性的细胞碎片，离心20,000克的裂解液在4 ° C 10分钟保持上清，弃去沉淀。
- 添加0.5 × 10 5〜2.5 × 10 5人与生物圈计划加上珠澄清裂解液，轻轻吹打混合。我们使用的体积最小执行一个单一的IP为5μL。
- 广场上的一个垂直旋转的轮子4小时，在寒冷的房间里过夜。设置足够的速度，以防止产生沉淀珠。量低IPS液体留在试管底部，在旋转过程中是可以接受的。
3。磁珠捕获蛋白质的探讨与荧光标记的抗体
- 洗净的IP珠在0.2至1.0毫升冰冷的FCM缓冲区，两次，离心20,000克在4 ° 3分钟后，每次冲洗的彗星。
- 重悬于100μL的FCM缓冲区和分装20μL到每个五年或以上的1.5 ml离心管或烟囱底板井珠。
- 样品加入荧光标记的单克隆抗体。执行染色的FCM根据供应商的指示，或根据经验确定的浓度的。作为一个起点，每管或添加0.2至1μL股票抗体溶液（0.2-1.0毫克/毫升），孵育40分钟冰。
- 洗净探讨在1.5毫升管珠两次为1.0 mL冰冷的FCM缓冲区，在20000克离心4 ° C为3分钟后，每次冲洗。每次清洗后轻轻地取出上清液，注意不要打扰珠。烟囱底板，用0.2毫升冰冷的FCM缓冲区，两次，离心5分钟，在4千克° C后每洗。多通道移液器这一步是非常有用的。若要从烟囱底板珠上清，“甩尾”的板一次，然后，同时仍然倒挂式，印迹边缘井滴水。在每口井的残留量，含珠，将约20μL。
- 重悬在每个样品200μL的FCM缓冲区的珠子。转移标记流式细胞仪管。样品现已FCM的准备。
4。 FCM的收购
在本议定书中所描述的慢性粒细胞白血病的珠子直径3至5微米，直径大约一半的一个静态的小鼠淋巴细胞。因此，它可能需要手动增加的前向散射（FSC）的放大器增益和侧散射（SSC），电压为珠事件的人口登记规模。单个IP珠子，应该形成一个紧密集群的单身人口。设置和门，应进行调整，以排除珠双峰和碎片。
- 之前运行的珠片或珠标准，除去周围一些流式细胞仪的进样液滴遏制套。允许鞘液样本之间的点滴，因为这将明确的入口和防止珠被结转从一个样品到另一个。
- 使用未标记的珠子，阴性对照的荧光，和彩虹校准颗粒（垃圾站），阳性对照的荧光，对设置进行调整，使双方的消极和积极的荧光极端同时出现在日志规模的X轴。这保证了实验样品的荧光，也将在规模。请注意，垃圾收集站，比CML珠小，因此，FSC和SSC参数，以及门的位置，可能需要暂时予以改变，样品。
- 与垃圾收集站的校准完成后，返回到未标记的珠设置。如果只有每一个样品的荧光探针，无荧光的补偿是必要的。在一般情况下，我们探头与每一个单一的荧光标记单克隆抗体流式细胞仪样品的多蛋白复合物，和我们研究了多种互动的合作伙伴，通过与具体的各亚基的单克隆抗体染色平行珠样品。
- 采集和保存数据文件荧光。分析然后可以使用流量，如流式细胞仪软件CellQuest，FlowJo，或cflow的。
5。代表性的成果
图1。 TCR/CD3多蛋白复合物的知识产权的FCM，T细胞的小鼠品系的BALB / C溶解在1％毛地黄皂苷，和裂解受到IP - FCM使用抗CD3ε珠。捕获复合物含有大量的T细胞受体-β（紫色区域），并联合相关CD3 -ε（绿色），但接近其他蛋白质，如Thy1.2的背景水平（不相关的免疫球蛋白探头，粉红色的跟踪定义）， CD45，或H - 2K（D）（棕色，橙色和蓝色的痕迹，分别）。类似先前公布的结果1-6。
Discussion
有关蛋白质相互作用的信息是高度相关的许多细胞过程，如信号转导，谱系成熟，细胞周期的进展，和凋亡级联的分析。 IP - FCM提供了快速，定量和敏感的方法，研究蛋白质的相互作用，并定义多蛋白复合物的成员在他们的天然构象。珠可以加上和培养细胞裂解液在一天之内，可以探测和分析第二天。一个96孔板格式允许对大量样品分析的数字，在同一时间提供高效的数据收集统计或筛选的目的。使用荧光珠标准，每个珠子捕获的蛋白质的数量可以估算的。源材料是很少需要捕捉和检测，使有限的样品和稀缺的分析物仍然可以为多个交互分析。虽然不需要IP - FCM的基因工程技术，抗原表位标记，变性，或在体外混合蛋白在非生理性的环境，它可以加上这些和其他技术，使得它与适用性的宝贵和访问工具许多生物系统。
故障排除：
许多IP - FCM的实验产生有用的蛋白质相互作用数据，他们首次尝试。然而，IP - FCM的优化可以提高抗体共轭珠，蛋白质复合体捕获，荧光探针结合。
可通过直接探测反免疫球蛋白抗体偶联珠IP抗体共轭的效率。如果效率低，增加在偶联反应的抗体浓度，可以让更多的IP抗体附加到每个珠子。这可以提高IP珠一批具有约束力的能力，增强型捕捉和分析物的检测。其他主要的胺（如三，牛血清白蛋白），其中包含分子不应该存在的偶联反应过程中，因为这些都可以与单克隆抗体的竞争珠附着在单克隆抗体低耦合的结果。如果共轭珠单抗证明问题等原因，珠，而不是可以被耦合到亲和素/链霉亲，生物素化抗体可以随后非共价键结合和immunprecipitation使用。
尽管良好的抗体共轭，初步检测珠相关的荧光可能偏低。第一，复杂的捕捉本身可能是低的。由于IP - FCM取决于分析物的浓度，增加单位的溶解量裂解细胞的数量，可提高分析物的捕获和检测。此外，捕捉可能是通过减少孵育裂解液，分配捕获复合物横跨珠少，增加每珠平均荧光探测的结果IP珠增强。其次，它是可能的探头抗体捕获复合物的访问是立体immunoprecipitating抗体阻碍。在这种情况下，问题可以得到解决，使用不同的抗体捕获和/或探针。
Acknowledgments
这项工作是由老鹰创新奖（联谊订购老鹰）和由梅奥基金会的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
