Summary
Questo video dimostra metodi per indurre transurethrally infezioni del tratto urinario del mouse e quantificare l'entità delle infezioni che ne derivano.
Abstract
Uropatogeni ceppi batterici di interesse vengono coltivate su agar. In generale, uropatogeni
Protocol
I. Preparazione dei cateteri uretrali
- Per ogni vescica del mouse e reni da campionare, posto 5-6 grani in acciaio inox (vescica, 1.6 mm o dimensione 0,9-2,0 miscela mm) o perle di ossido di zirconio (rene, 0,5 mm di diametro) in una provetta provetta Microbank ™, rispettivamente. Autoclave il tallone contenenti tubi.
- Dopo i tubi raffreddare a temperatura ambiente, aggiungere 200 microlitri di PBS sterile ad ogni acciaio inox tallone contenenti tubi e 400 microlitri di PBS sterile ad ogni ossido di zirconio contenenti perline tubo.
- Prepariamo cateteri uretrali come descritto da Hung e Hultgren 13. Autoclave una coppia pulita di testa piatta pinze e forbici fine (iride o altri tipi) e lasciare gli strumenti per raffreddare a temperatura ambiente. Pulire le superfici di una cappa a flusso laminare con il 70% di etanolo. Nel cofano, tagliare una (approssimativa) segmento 30 cm di tubo di polietilene. Asetticamente inserire un ago sterile da 30 gauge (1 / 2 pollice ago lungo) su una sterile siringa da 3 cc. Prendete una delle estremità del tubo in polietilene tagliato con le pinze in autoclave e far scorrere il tubo l'ago fino ad incontrare il mozzo. Tagliare il tubo in modo che circa 2 cm si estende oltre la punta dell'ago. Rimuovere il catetere dalla siringa e posto in una piastra di Petri sterile.
- Per ridurre la probabilità di contaminazione incrociata, facciamo un catetere per ogni mouse. Dopo tutti i cateteri sono fatti, li sterilizzare in esposizione in un tegame scoperto petri ai raggi UV per almeno 30 minuti. Non guardare direttamente le lampade UV o esporre qualsiasi parte del corpo della cappa, mentre le lampade sono attivati. Dopo l'esposizione ai raggi UV, cateteri possono essere conservati a lungo termine nella capsula di Petri. Si consiglia di sigillare il piatto con Parafilm per aiutare a mantenere la sterilità.
II. Inoculazione degli animali
- I topi dovrebbero arrivare almeno una settimana prima di manipolazione sperimentale al fine di evitare fattori di confondimento indotta da stress. Topi di sesso femminile sono utilizzati per l'uretra maschile del mouse è estremamente difficile da cateterizzare. CBA / J è un comunemente utilizzata, UTI sensibili ceppo di topi inbred. I topi devono essere utilizzati tra 8 e 12 settimane di età, poiché questa è la finestra di maturità immunologica prima della senescenza. Il primo giorno dell'esperimento, immergere la fine di un ciclo sterile inoculare in una fiala di batteri congelati magazzino. Raschiare un inoculo piccolo e fuori vena su una piastra di agar adeguato. In generale, uropatogeni E. coli (UPEC) e altri ceppi possono essere coltivate pernottamento a Luria-Bertani (LB) agar a 37 ° C nell'aria ambiente. Ceppi UPEC crescere come solido, colonie traslucido bianco-giallastro su agar LB. Restituire immediatamente il brodo batterica al congelatore. Ceppi uropatogeni batterica può diventare meno virulento nel tempo con ripetute, le culture di serie. Quindi, si consiglia di striature un piatto fresco agar per ogni esperimento.
- Il giorno 2 di questo esperimento, dopo aver confermato la morfologia propria colonia, raccogliere singole colonie sulle piastre di agar e il luogo in almeno 5 cc di brodo di cultura durante la notte. LB brodo può essere utilizzato per i ceppi batterici più uropatogeni (37 ° C, 200 giri in aria ambiente). Tenere i tappi scioglierai sulla tubi cultura il brodo per permettere l'aerazione.
- Il giorno 3 di questo esperimento, prendere il 10% della cultura brodo di primo e cultura in brodo di nuovo durante la notte (di solito 37 ° C min e 200), per aumentare l'espressione di tipo I pili. Culture brodo seriale aiutare ad ottimizzare uropathogenicity batterica, dal momento che pili di tipo I hanno dimostrato di essere un fattore critico per la virulenza uropatogeni in vivo 1. Tenere i tappi scioglierai sulla tubi cultura il brodo per permettere l'aerazione.
- Il giorno 4 dell'esperimento, misurare il diametro esterno 600 del brodo di cultura fin dal primo giorno 3. Se non è già noto per il ceppo batterico in fase di test, eseguire dieci volte placcatura seriale diluizione nel corso di almeno 7 log (diluizioni effettuate con PBS, le culture eseguita su agar LB, 37 ° C notte di incubazione) per determinare il rapporto tra diametro esterno 600 e cfu / ml. Come regola generale, un OD 600 del 0,4-0,5 corrisponde in genere a 1-2x10 7 cfu per 50 microlitri. Una volta che il rapporto tra diametro esterno 600 e ufc / ml è stata determinata, si può regolare il brodo di cultura per l'OD 600 cfu corrispondenti ai desiderata per il mouse in 50 microlitri di PBS. Alcuni lavori hanno suggerito che l'inoculazione di 10 microlitri, piuttosto che 50, porta a meno reflusso nel kidneys6. Tuttavia, la maggior parte delle pubblicazioni hanno segnalato l'uso di 50 microlitri per mouse. In generale, gli intervalli di cfu desiderata tra 10 6 e 108 ufc / mouse, ma ogni combinazione ceppo batterico / mouse deve essere empiricamente testato in vivo.
- Per far sì che inoculi non siano annullate subito dopo l'instillazione, topi dovrebbero essere privati di acqua per almeno 30 minuti prima dell'induzione dell'anestesia generale. Un'altra manovra chiave è quello di indurre la minzione prima dell'induzione dell'anestesia da scruffing topi e spingendo delicatamente la abdom inferioreit. Due al 2,5% isoflurano è una dose di induzione sicuro per 8-12 settimana di vita topi femmina CBA, seguita da mantenimento con anestesia 1,8-2% isoflurano.
- Una volta che l'anestesia è raggiunto, i topi sono posti in posizione supina con la testa inserita in un collegato alla nosecone isoflurano contenenti ossigeno. Basso addome viene massaggiato per evacuare l'urina dalla vescica. Se la vescica è relativamente vuota, questa manovra non può produrre l'urina. Basso addome e perineo è imbevuto di etanolo al 70%.
- Una sterile 1 siringa senza ago cc viene usato per redigere l'inoculo desiderato batterica. Poi, un catetere uretrale sterile è asettico posto sulla siringa. Il tubo in eccesso viene tagliato il catetere con un paio di forbici in modo che solo 1-2 millimetri di tubi rimangono distale rispetto alla punta dell'ago. Poi, la siringa è sfruttato e lo stantuffo depresso con la siringa in posizione verticale per rimuovere tutte le bolle. Un ciuffo di lubrificante batteriostatico gelatina è schizzato su una piastra di Petri sterile o l'interno della confezione di siringa sterile. La punta del catetere (con siringa allegato) è immerso nella gelatina. Se più ceppi batterici sono in fase di test nello stesso esperimento, fare attenzione a non utilizzare la stessa goccia di gelatina per lubrificare cateteri contenenti ceppi diversi.
- Utilizzando un microscopio stereo (0,8 x per gamma di zoom 5x) per l'ingrandimento, il cappuccio del clitoride anestetizzato del mouse viene delicatamente colto nella mano non dominante con un paio di pinze a denti fini e cresciuto cranialmente esporre il profondo meato uretrale rosa ( Figura 1). La siringa (con catetere allegato) è colto nella mano dominante con una presa matita e la punta del catetere è impegnata nel meato uretrale con un angolo di 45 gradi. Il cappuccio del clitoride è allungato lungo l'asse della siringa, in modo efficace "carico" l'uretra sul catetere. Questa manovra è fondamentale perché l'uretra del mouse è ridondante. Il catetere deve scorrere facilmente in vescica (fino al mozzo, Figura 2), e può essere leggermente arricciati per navigare le pieghe ridondanti dell'uretra. Una volta che il catetere è hubbed, la siringa può essere abbassato fino a quando non è parallelo con l'asse longitudinale del mouse. La mano non dominante può scendere la pinza per contribuire a stabilizzare la posizione del catetere e la siringa come la mano dominante è usata per iniettare lentamente l'inoculo (almeno 5 secondi). Se il liquido è visto che scorre intorno al catetere durante l'iniezione, sia la vescica è piena o il catetere è nella vagina (appena caudalmente per l'uretra). Iniezione deve essere immediatamente interrotto e la posizione del catetere attentamente esaminato. Se il catetere è stato nell'uretra, il mouse dato non deve essere incluso nell'esperimento. D'altra parte, un catetere fuori luogo nella vagina può essere riposizionata e il tentativo di ri-iniezione. Dopo l'iniezione, il catetere e la siringa è lentamente ritirato dal mouse.
- Per ridurre la probabilità del primo post-inoculazione minzione, che possono evacuare batteri somministrati, e quindi portare a livelli di infezione variabile, alcuni ricercatori mantenere topi sotto anestesia per 30 minuti dopo transuretrale inoculation10. Dopo l'intervento chirurgico, i topi dovrebbe recuperare su una coperta riscaldamento pulito, con osservazione continua a confermare ritorno della respirazione e attività normali. Una volta che gli animali hanno completamente recuperato la capacità di strisciare, possono essere restituiti a letto contenenti gabbie.
III. CFU misura in tessuto infetto
- Varie pubblicazioni del mouse UTI hanno riferito sui risultati della cultura da 6 ore ad una settimana o più dopo l'inoculazione. I punti di tempo ottimali devono essere determinati empiricamente per ogni combinazione ceppo batterico / mouse. Urine emesse si ottiene per la cultura da scruffing del mouse su una piastra di Petri sterile. Urine raccolte devono essere tenuti in ghiaccio in ogni momento. Più tentativi di ottenere l'urina annullate molte ore può essere necessario, dato che lo svuotamento del mouse è frequente, a basso volume (30-100 microlitri per nulla), e lo stress-dipendente.
- Dopo aver ottenuto i campioni di urina annullata, sacrifichiamo topo, utilizzando dislocazione isoflurano e cervicale. L'addome è aperto in modo asettico. Se un campione di urina non è stata annullata con successo ottenuto in precedenza, una piccola quantità di urina può spesso essere aspirato attraverso la parete della vescica con un ago da 30 gauge e siringa.
- Uno o entrambi i reni sono stati rimossi, tritati in almeno 4 pezzi (ogni pezzo deve essere inferiore a 50 microgrammi) su una piastra di Petri sterile, e messo in zirconio tallone / PBS contenenti cryovials sul ghiaccio. La vescica viene rimosso, tritati in almeno 4 pezzi, e messo in acciaio inox tallone / PBS contenenti cryovials sul ghiaccio. Il tessuto / perla / PBS contenenti cryovials sono posti in un proiettile omogeneizzatore Blender e dei tessuti vengono omogeneizzati utilizzando l'impostazione "8" di velocità per un minuto. E 'comune per alcuni frammenti di tessuto a restarvi dopo omogeneizzazione. Finché 50-100 microlitri di omogenato liquido può essere pipettati, frammenti solidinon sono necessariamente un problema. Se il tempo di omogeneizzazione è aumentato per alcuni campioni, è importante farlo per tutti i tessuti al fine di mantenere la coerenza di omogeneizzazione. Utilizziamo un proiettile Blender omogeneizzatore perché evita la possibilità di contaminazione incrociata, è più rapida elaborazione singoli campioni uno dopo l'altro utilizzando un omogeneizzatore standard, e non in modo significativo il calore dei campioni viene omogeneizzato.
- Almeno due o tre dieci volte diluizioni di urina raccolte e omogenati di tessuto deve essere fatta in una micropiastra. Per gli esperimenti preliminari può essere prudente fare almeno sette dieci volte diluizioni. Cultura fino a 100 microlitri di urina, vescica e / o omogenati di rene su agar appropriato. Dal momento che i campioni di urina possono essere volume limitato, può essere necessario per portare i loro volumi da 100 microlitri prima di eseguire dieci volte diluizioni. Se questo è richiesto, la diluizione iniziale (prima diluizione decimale) dovrà essere preso in considerazione in calcoli finali dei rendimenti batterica. Noi preferiamo UPEC colture sulla eosina-blu di metilene o agar MacConkey (notte di incubazione a 37 ° C), dal momento che questi media sono selettivi per i batteri Gram-negativi. Ceppi UPEC crescono su agar MacConkey come centrale ombelicate, colonie grazie alla loro capacità di fermentare il lattosio rosso-rosa.
- Dopo la cultura durante la notte, contare le CFU per ogni piatto. Per i campioni diluiti serialmente, la diluizione piatto contenente 50-100 colonie è considerato il conteggio più accurato. "Indietro" calcolare ufc per tessuto, per ogni milligrammo di tessuto, o per ml.
IV. Rappresentante Risultati
Figura 1. Meato uretrale (scuro tessuto rosa) esposti sollevando cappuccio del clitoride cefalica con una pinza (al di là in alto nella foto)
Figura 2. Cateterizzati uretra. Il clitoride bifido può essere visto appena sopra il catetere.
Figura 3. Vescica cfu conta 2 giorni dopo l'infezione transuretrale di 8 settimane di età femminile CBA / J topi con uropatogeni E. coli. Vesciche sono stati omogeneizzati e ufc / ml determinato dalla placcatura di diluizione in serie su agar MacConkey. Diamanti indicare ufc / ml per i singoli topi, barra orizzontale indica la mediana ufc / ml.
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Discussion
Induzione di infezioni del tratto urinario del mouse tramite l'inoculazione di batteri transuretrale è una procedura ormai consolidata, ma tecnicamente impegnativo 11. Hung e Hultgren recentemente pubblicato un eccellente rassegna di tecniche transuretrale di infezione del tratto urinario del mouse 13. In questo lavoro, cerchiamo di illustrare ulteriormente i punti più fini di questo approccio sperimentale.
I novizi possono praticare la loro tecnica eseguendo una laparotomia mediana per esporre la vescica, l'iniezione di una soluzione diluita di inchiostro di china (1% in PBS), e osservando per la colorazione blu della vescica. Abbiamo scoperto che una vescica piena è uno dei problemi più difficili da affrontare durante l'iniezione del mouse uretrale, ed è meglio impedita dalla privazione di acqua e di pre-anestesia strategie di svuotamento di cui sopra. Nelle nostre mani, <10% dei topi mostrano troppo pieno di urina durante l'iniezione uretrale. Un altro blocco potenziale ostacolo è cateterizzazione traumatica, che può portare alla perforazione uretrale, le dosi improprio di inoculi vescica, e persino la morte dell'animale. Tecnica delicata e pazienza sono fondamentali durante la cateterizzazione, la cateterizzazione successo non dovrebbe richiedere forzando il catetere nella vescica.
Infine, alcuni laboratori potrebbero non voler usare un proiettile Blender omogeneizzatore o altri "il throughput medio" omogeneizzatore, sia a causa di un numero campione di bassa o considerazioni di costo. Una soluzione intermedia è quella di utilizzare un omogeneizzatore standard e pulire il dispositivo tra ogni campione. La soluzione più economica è l'uso del vetro macine, che abbiamo utilizzato con successo prima di passare alla pallottola omogeneizzatore Blender. Indipendentemente dal metodo di omogeneizzazione dei tessuti utilizzati, meticoloso, una tecnica asettica, e coerenti sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Shelly Xie e Jennifer Payne per la loro assistenza tecnico esperto. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso sovvenzioni da parte della Società di Urologia Pediatrica e lo Stanford Research Pediatric Fondo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
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