Summary
このビデオでは、経尿道的にマウスの尿路感染症を誘発し、結果として感染症の程度を定量化する方法を紹介します。
Abstract
興味の尿路病原性菌株は、寒天上で増殖されています。一般的に、尿路疾患
Protocol
尿道カテーテルのI.準備
- 各マウスの膀胱及びサンプリングする腎臓の場合は、それぞれ1クライオバイアルチューブ5-6ステンレススチール製ビーズ（膀胱、1.6 mmのサイズまたは0.9〜2.0ミリメートルのブレンド）または酸化ジルコニウムビーズ（腎臓、0.5mmのサイズ）を配置。ビーズを含むチューブをオートクレーブ。
- 周囲温度に冷却管の後、各ステンレススチールビーズを含むチューブと各酸化ジルコニウムビーズを含むチューブに滅菌PBS 400マイクロリットルに滅菌PBSの200マイクロリットルを追加。
- ハングアップしたとHultgren 13で説明したように我々は、尿道カテーテルを準備。フラットヘッド鉗子と細かいハサミ（虹彩または類似の型）のきれいなペアをオートクレーブと楽器が周囲温度まで冷却することができます。 70％エタノールで層流フードの表面を拭いてください。フードでは、ポリエチレンチューブの30cm（おおよその）セグメントをカット。無菌的に滅菌3 ccシリンジに滅菌30ゲージの針（1 / 2インチ長い針）を置きます。オートクレーブ滅菌ピンセットでカットポリエチレンチューブの一端をピックアップし、それがハブを満たすまで、針の上にチューブをスライドさせます。約2cmの針の先端を超えるようにチューブをカット。滅菌ペトリ皿の中で注射器と場所からカテーテルを削除します。
- 交差汚染の可能性を低減するため、我々は、それぞれのマウスで、もう1つカテーテルを行います。すべてのカテーテルが行われた後、少なくとも30分間UV照射するために、カバーペトリ皿の中での曝露によって、それらを滅菌する。 UVランプを直接見たり、ランプが活性化されている間フードで体のどの部分を公開しないでください。 UV露光後、カテーテルをシャーレでの長期保存することができます。私たちは、無菌性を維持するためにパラフィルムで皿を密封することをお勧めします。
II。動物接種
- マウスは、ストレス誘発性の交絡因子を避けるために実験的操作の前に少なくとも週に到着してください。雄マウスの尿道はカテーテルを挿入することは極めて困難であるため、雌マウスが使用されます。 CBA / Jは一般的に利用、UTI -感受性の近交系マウス系統です。これは老化の前に免疫学的成熟度のウィンドウであるため、マウスは、生後8〜12週間の間に使用する必要があります。実験の初日に、凍結した細菌株のバイアルに滅菌白金耳の端を浸し。適切な寒天プレートに小さな接種とストリークを集める。一般的に、尿路病原性E.大腸菌 （UPEC）と他の株は37℃ルリア-ベルターニ（LB）寒天培地上で一晩成長させることができる·周囲空気中のC。 UPECの菌株は、LB寒天培地上に固体、黄色がかった白色半透明のコロニーとして成長する。すぐに冷凍庫に細菌株を返します。尿路病原性細菌株は繰り返し、シリアル文化との時間をかけて弱毒になることができます。したがって、我々は、各実験のための新鮮な寒天プレートをストリーキングをお勧めします。
- 実験の2日目に、適切なコロニー形態を確認した後、一夜ブロス培養物の少なくとも5 ccで寒天プレートと場所から単一のコロニーを選択。 LBブロスは、ほとんどの尿路病原性菌株（37℃、周囲空気中で200 rpm）に使用することができます。通気を可能にするためにブロス培養管にキャップが緩んでおいてください。
- 実験の3日目に、I型線毛の発現を増強するために、（通常37℃、200rpm）し、再び一晩培養液の最初のブロス培養物および培養の10％を取る。 I型線毛は、 生体 1 の uropathogensのための重要な病原因子であることが示されているので、シリアルブロス培養は、細菌のuropathogenicityを最適化するのに役立ちます。通気を可能にするためにブロス培養管にキャップが緩んでおいてください。
- 実験の4日目に、3日目からブロス培養物のOD 600を測定する 。既にテストされている菌株については知られていない場合、OD 600とCFUの関係を決定するために少なくとも7ログ（PBSで行わ希釈、LB寒天上で実行される文化を、37℃インキュベーション一晩）を介して十倍希釈系列のメッキを行う/ mlの。経験則として、0.4から0.5のOD 600は、一般的に50マイクロリットルあたり1 × 10 7 CFUに対応しています。 OD 600とcfu / mlの間の関係が決定されると、1つはPBSの50マイクロリットルのマウスあたり希望のCFUに対応するOD 600ブロス培養物を調整することができます。いくつかの作品は、むしろ50より10マイクロリットルの接種は、kidneys6に少ない逆流につながることを示唆している。しかし、ほとんどの出版物は、マウス当たり50マイクロリットルを使用することを報告している。一般に、10 6および108 CFU /マウス間のCFUの範囲を望ましいが、それぞれの細菌/マウス系統の組み合わせは経験的に生体内でテストする必要があります。
- その接種を確保するために、注入後すぐには無効とされていない、マウスは全身麻酔の導入前に少なくとも30分間水を奪われるはず。別のキー操作は、マウスをscruffingことによって、麻酔導入前にボイド誘導ゆっくりと下abdomを押すのです。バス。イソフルラン2〜2.5％が1.8から2パーセントイソフルランとメンテナンスの麻酔が続く8月12日週齢の雌のCBAマウスのための安全な誘導の用量、である。
- 麻酔が達成されると、マウスは、イソフルラン含有酸素に接続されているノーズコーンに挿入された彼らの頭と仰臥位に配置されます。下腹部は膀胱から尿を排出するマッサージ。膀胱は比較的空の場合、この操作は、尿が得られないことがあります。下腹部や会陰部を70％エタノールに浸漬される。
- 針のない滅菌1 ccシリンジは、所望の細菌の接種を策定するために使用されます。次に、滅菌尿道カテーテルは、無菌的にシリンジに配置されます。チューブのわずか1〜2ミリの針の先端に遠位残るように余分なチューブは、ハサミでカテーテルを切断される。その後、注射器が盗聴されており、プランジャーは、すべての気泡を除去するために直立シリンジで落ち込んで。静菌性潤滑ゼリーをほんの少し加えたは、滅菌ペトリ皿または無菌の注射器のラッパーの内部に噴出される。カテーテルの先端は、（添付シリンジ）ゼリーに浸漬する。複数の菌株が同一の実験でテストされている場合、別の菌株を含むカテーテルを潤滑するためにゼリーの同じドロップを使用しないように注意してください。
- 倍率のステレオ顕微鏡（5倍ズームの範囲に0.8倍）を使用して、麻酔マウスの陰核包皮を穏やかに微歯ピンセットで非利き手で把握されており、深いピンクの尿道口を（公開する頭側に引き上げ図1）。注射器は、（添付カテーテル付き）鉛筆のグリップを利き手で把握されており、カテーテルの先端を45度の角度で尿道口に従事している。陰核包皮が注射器の長軸に沿って引き伸ばされ、効果的にカテーテルに尿道を"ロード"。マウスの尿道が冗長であるため、この操作は必須です。カテーテルは膀胱（最大ハブに、図2）に簡単にスライドするはず、とそっと尿道の冗長なひだを移動するためにくるくるすることができます。カテーテルが減衰します。つまりされたらそれはマウスの長軸と平行になるまで、注射器を下げることができる。非利き手では利き手のようなカテーテルと注射器の位置を安定させるために鉗子をドロップすることができますゆっくり接種（少なくとも5秒）をインジェクトするために使用されます。流体が注入時にカテーテルの周囲に流れて見られる場合は、膀胱のどちらかがフルになる、またはカテーテルは、膣（尿道にちょうど尾側）になります。注射はすぐに停止し、カテーテルの位置は慎重に検討する必要があります。カテーテルが尿道にあった場合、与えられたマウスは、実験には含まれるべきではない。一方、膣に見当違いのカテーテルを再配置することができますし、注入は、再試行。注入後、カテーテルと注射器をゆっくりとマウスから引き出される。
- 投与細菌を避難させると、それによって変数の感染レベルにつながる可能性のある早期の接種後の排尿、の可能性を減らすために、いくつかの研究者は、経尿道的inoculation10後30分間麻酔下でマウスを維持する。手術後、マウスは正常な呼吸パターンと活動のリターンを確認するために、連続観測でクリーンな地球温暖化の毛布の上に回復する必要があります。かつて動物が完全にクロールするための能力を回復した、それらは寝具含有ケージに戻されることがあります。
III。感染組織における測定CFU
- 様々なマウスUTIの出版物は、6時間から1週間以上、接種後に培養結果に報告されている。最適な時点は、各細菌/マウス系統の組み合わせのために実験的に決定する必要があります。排せつされた尿は無菌のペトリ皿の上にマウスをscruffingによって培養のために取得されます。採取した尿は常に氷上で保存する。マウスの排尿は、頻繁に（ボイドあたり30から100マイクロリットル）音量が低い、とストレスに依存するので、多くの時間で排せつされた尿を得るために複数の試みは、必要な場合があります。
- 排せつされた尿検体を得た後、私たちはイソフルランと頚椎脱臼を使用してマウスを生け贄に捧げる。腹部を無菌的に開かれます。排せつされた尿検体が正常に以前取得されなかった場合、少量の尿が頻繁に30ゲージの注射針と注射器を使用して膀胱の壁を通って吸引することができます。
- 一方または両方の腎臓を取り出し、滅菌ペトリ皿上に少なくとも4個（各部分が50マイクログラム未満でなければなりません）にミンチ、そして氷の上でジルコニウムビーズ/ PBS含有cryovialsに配置されます。膀胱は、削除、少なくとも4個に細切し、およびステンレス鋼のビード/氷上でPBS含有cryovialsに配置されます。組織/ビーズ/ PBS含有cryovialsは、ブレットブレンダー、ホモジナイザーに配置され、組織が1分間"8"速度設定を使用してホモジナイズしている。一部の組織片が均質化した後に残されることが一般的です。液体ホモジネートの50〜100マイクロリットルをピペッティングすることができる限り、固体の断片必ずしも問題ではありません。均質化の時間が一部のサンプルの増加させると、それは均質化の一貫性を維持するために、すべての組織のためにそうすることが重要です。それは、交差汚染の可能性を回避するため、我々はブレットブレンダー、ホモジナイザーを使用、個々のサンプルの標準ホモジナイザーを使用して1つずつ処理するよりも迅速である、と大幅に均質化されているサンプルを加熱していません。
- 採取した尿および組織ホモジネートの少なくとも二、三十倍希釈液をマイクロタイタープレートで行う必要があります。予備実験のためにそれは、少なくとも7つの十倍希釈を行うことが賢明であろう。尿、膀胱、および/または適切な寒天で腎臓のホモジネートを100マイクロリットルの文化まで。尿検体は、ボリューム制限の可能性があるので、それは10倍希釈を行う前に100マイクロリットルにそれらのボリュームを持ってする必要があるかもしれません。これが必要な場合は、最初の希釈は、（十倍希釈前）細菌の収量の最終的な計算に分解する必要があります。これらのメディアは、グラム陰性菌に対して選択的であるため、我々は、エオシンメチレンブルーやマッコンキー寒天培地（37℃で一晩インキュベートC）で培養UPECを好む。 UPEC株は乳糖を発酵する能力のために集中的に臍窩、赤ピンクコロニーとしてマッコンキー寒天培地で成長する。
- 一晩培養後、各プレートのためのCFUをカウント。希釈したサンプルについては、50から100コロニーを含むプレートの希釈は、最も正確な数とみなされます。 "戻る"組織ごと、組織のミリグラム当たり、または1mlあたりCFUを算出する。
IV。代表的な結果
図1。鉗子で頭側に陰核包皮を持ち上げて露出尿道口（濃いピンク組織）（写真の上を越えて）
図2。尿道をカテーテルを挿入。二分クリトリスはちょうどカテーテル上に見ることができます。
図3。膀胱CFUは2日間尿路病原性大腸菌を8週齢の雌のCBA / Jマウスの経尿道感染後のカウント大腸菌 。膀胱はマッコンキー寒天培地上で連続希釈メッキして均質化し、CFU / mlを決定した。ダイヤモンドは、水平のバーが中央値CFU / mlを示し、個々のマウスについてはCFU / mlを示している。
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Discussion
細菌の経尿道的接種によるマウス尿路感染症の誘導は、老舗が技術的な要求手順11です。ハングとHultgrenは最近、マウス尿路感染症13の経尿道的技術の優れたレビューを発表した。本稿では、さらにこの実験的なアプローチの細かい点を説明しよう。
初心者は、膀胱を公開する正中開腹術を行うインドインク（PBS中の1％）の希釈溶液を注入し、膀胱の青色着色のために観察することによって彼らのテクニックを実践している可能性があります。我々は完全な膀胱がマウス尿道注入時に対処する最も難しい問題の1つであることを発見した、と最高の水の欠乏と上記プレ麻酔排尿戦略によって防止される。私たちの手で、マウスの<10％は尿道注入時の尿のオーバーフローを示す。もう一つの潜在的なつまずきは尿道穿孔、膀胱の接種の不適切な投与量、さらには動物の死につながることができる外傷性カテーテル、です。穏やかなテクニックと忍耐は、カテーテル挿入時のキーであり、成功したカテーテルは膀胱にカテーテルを強制的に必要とすることはありません。
最後に、いくつかの研究室では、ブレットブレンダー、ホモジナイザーまたは低いサンプルの番号またはコストの考慮事項により、どちらかの他の"ミディアムスループット"ホモジナイザーを、使用を希望されない場合があります。中間的な解決策は、標準のホモジナイザーを使用し、各サンプル間でデバイスをクリーニングすることです。最も経済的な解決策は、我々は正常に弾丸ブレンダー、ホモジナイザーに切り替える前に採用したガラス粉砕機の使用です。に関係なく使用される組織の均質化法の、細心の、無菌、および一貫性のあるテクニックは、再現性のある結果を得るために不可欠です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は彼らの専門的な技術支援のためにシェリー謝とジェニファーペインに感謝します。この作業は小児泌尿器科とスタンフォード小児研究基金協会からの助成金を戴いています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
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