Summary
Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.
Abstract
Cepas bacterianas uropathogenic de interesse são cultivadas em ágar. Geralmente uropathogenic,
Protocol
I. Elaboração de cateteres uretrais
- Para cada bexiga e rim do rato a amostrar, coloque 5-6 grânulos de aço inoxidável (bexiga, 1,6 mm ou tamanho 0,9-2,0 mistura mm) ou grânulos de óxido de zircônio (rim, tamanho 0,5 mm) em um tubo de cryovial, respectivamente. Autoclave os tubos contendo talão.
- Após os tubos esfriarem até a temperatura ambiente, adicionar 200 microlitros de PBS estéril a cada tubo de aço inoxidável contendo talão e 400 microlitros de PBS estéril a cada tubo de óxido de zircônio contendo talão.
- Nós preparamos cateteres uretrais, como descrito por Hung e Hultgren 13. Autoclave um par limpo de flat-cabeça pinças e tesouras finas (íris ou tipo similar) e permitir que os instrumentos para esfriar a temperatura ambiente. Limpe as superfícies de uma capela de fluxo laminar com etanol 70%. Na capa, corte um segmento de 30 centímetros (aproximado) de tubos de polietileno. Assepticamente colocar uma agulha estéril 30 (meia polegada longa agulha) em uma seringa estéril cc 3. Pegue uma das extremidades do tubo de polietileno de corte com a pinça autoclavado e deslize o tubo na agulha até encontrar o hub. Cortar o tubo de modo que cerca de 2 centímetros se estende além da ponta da agulha. Remover o cateter da seringa e colocar em uma placa de Petri estéril.
- Para reduzir a probabilidade de contaminação cruzada, fazemos um cateter para cada rato. Depois de todos os cateteres são feitos, esterilizá-los pela exposição em uma placa de Petri descoberto à radiação UV por pelo menos 30 minutos. Não olhe diretamente para as lâmpadas UV ou expor qualquer parte do corpo no capô enquanto as lâmpadas são ativadas. Após a exposição UV, os cateteres podem ser armazenados a longo prazo na placa de Petri. Recomendamos selando o prato com Parafilm para ajudar a manter a esterilidade.
II. Inoculação em animais
- Ratos deve chegar pelo menos uma semana antes da manipulação experimental, a fim de evitar o stress induzido por fatores de confusão. Camundongos fêmeas são usados porque a uretra masculina do mouse é extremamente difícil de cateterização. CBA / J é um comumente utilizados, UTI suscetíveis à tensão do mouse puras. Camundongos devem ser usados entre 8 e 12 semanas de idade, uma vez que esta é a janela imunológica de maturidade antes da senescência. No primeiro dia do experimento, mergulhe o fim de um ciclo estéril da inoculação em um frasco de estoque de bactérias congeladas. Desenterrar um inóculo pequenos e fora de raia em uma placa de ágar apropriado. Geralmente, uropathogenic E. coli (UPEC) e de outras variedades podem ser cultivadas durante a noite em Luria-Bertani agar (LB) a 37 ° C no ar ambiente. Cepas UPEC crescer como sólido, branco-amarelada translúcida colônias em ágar LB. Devolver imediatamente o estoque de bactérias para o freezer. Cepas bacterianas uropathogenic pode tornar-se menos virulento ao longo do tempo com repetidas, as culturas de série. Por isso, recomendamos listando fora uma placa de agar fresco para cada experimento.
- No dia 2 do experimento, após a confirmação de morfologia das colônias adequada, pick colônias única a partir de placas de ágar e colocar em pelo menos 5 cc caldo de cultura durante a noite. LB pode ser usado para cepas mais uropathogenic bacteriana (37 ° C, 200 rpm no ar ambiente). Mantenha as tampas soltas sobre os tubos de caldo de cultura para permitir a aeração.
- No dia 3 do experimento, tomam 10% do caldo da cultura primeira e cultura em caldo novamente durante a noite (tipicamente 37 ° C e 200 rpm), para aumentar a expressão do tipo I pili. Culturas caldo Serial ajudar a otimizar uropathogenicity bacteriana, uma vez que pili tipo I tem se mostrado um fator de virulência essencial para uropatógenos in vivo 1. Mantenha as tampas soltas sobre os tubos de caldo de cultura para permitir a aeração.
- No dia 4 do experimento, medir o OD 600 da cultura caldo do dia 3. Se não já conhecidos para a cepa bacteriana que está sendo testado, executar dez vezes à diluição em série ao longo de pelo menos 7 logs (diluições realizadas com PBS, as culturas realizadas em ágar LB, 37 ° C durante a noite de incubação) para determinar a relação entre OD e 600 ufc / ml. Como regra geral, um OD 600 de 0,4-0,5 geralmente corresponde a 1-2x10 7 ufc por 50 microlitros. Uma vez que a relação entre OD e 600 ufc / ml foi determinado, pode-se ajustar o caldo de cultura para o OD 600 correspondente ao ufc desejado por rato em 50 microlitros de PBS. Alguns trabalhos sugerem que a inoculação de 10 microlitros, em vez de 50, leva a uma menor refluxo para o kidneys6. No entanto, a maioria das publicações têm relatado o uso de 50 microlitros por mouse. Geralmente, os intervalos ufc desejado entre 10 6 e 108 ufc / mouse, mas cada combinação estirpe bacteriana / mouse precisa ser empiricamente testado in vivo.
- Para ajudar a garantir que inóculos não são anulados imediatamente após a instilação, os ratos deveriam ser privados de água por pelo menos 30 minutos antes da indução da anestesia geral. Outra manobra fundamental é induzir esvaziamento antes da indução da anestesia por scruffing ratos e pressionando suavemente a parte inferior abdomen. Dois a 2,5% do isoflurano é uma dose segura para a indução 8-12 semanas de idade camundongos fêmeas CBA, seguido de anestesia de manutenção com 1,8-2% isoflurano.
- Uma vez que a anestesia é alcançado, os ratos são colocados em posição supina com a cabeça inserido em um cone de nariz ligado ao isoflurano contendo oxigênio. Parte inferior do abdome é massageado para evacuar a urina da bexiga. Se a bexiga está relativamente vazio, esta manobra pode não produzir urina. Parte inferior do abdómen e do períneo é embebido com álcool 70%.
- Uma seringa estéril 1 cc sem agulha é usada para elaborar o inóculo desejado bacteriana. Em seguida, um cateter uretral estéril é colocado assepticamente na seringa. A tubulação em excesso é cortar o cateter com uma tesoura de modo que somente 1-2 milímetros de tubos permanecem distal à ponta da agulha. Em seguida, a seringa é aproveitado eo êmbolo deprimido com a seringa na posição vertical para remover todas as bolhas. Um montão de lubrificante bacteriostático geléia é esguichou em uma placa de Petri estéril ou o interior do invólucro seringa estéril. A ponta do cateter (com seringa em anexo) é mergulhado na geléia. Se múltiplas cepas bacterianas estão sendo testados no mesmo experimento, tenha cuidado para não usar a mesma queda de geléia para lubrificar cateteres contendo diferentes cepas.
- Usando um microscópio estéreo (0,8 x a faixa de zoom 5x) para ampliação, o capuz do clitóris do mouse anestesiados é gentilmente agarrou na mão não-dominante com um par de pinças de dentes finos e levantou cefálica para expor o fundo rosa meato uretral ( Figura 1). A seringa (com cateter em anexo) é agarrado na mão dominante, com um aperto de lápis ea ponta do cateter está envolvida no meato uretral em um ângulo de 45 graus. O capuz do clitóris é esticada ao longo do eixo da seringa, de forma eficaz "loading" a uretra para o cateter. Esta manobra é essencial, pois a uretra do mouse é redundante. O cateter deve deslizar facilmente para a bexiga (até o hub, Figura 2), e pode ser gentilmente girou para ajudar a navegar as dobras redundantes da uretra. Uma vez que o cateter é hub, a seringa pode ser reduzida até que esteja paralela com o longo eixo do mouse. A mão não-dominante pode soltar o fórceps para ajudar a estabilizar a posição do cateter e seringa como a mão dominante é utilizada para injectar lentamente o inóculo (pelo menos 5 segundos). Se o líquido é visto fluindo ao redor do cateter durante a injeção, seja a bexiga está cheia ou o cateter é na vagina (apenas caudal para a uretra). Injecção deve ser imediatamente interrompido e da posição do cateter cuidadosamente examinada. Se o cateter foi na uretra, o rato dado não deve ser incluído no experimento. Por outro lado, um cateter extraviado na vagina pode ser reposicionada ea injeção re-tentada. Após a injeção, o cateter ea seringa é lentamente retirado do mouse.
- Para reduzir a probabilidade de esvaziamento pós-inoculação precoce, o que pode evacuar bactérias administrados e, assim, levar a níveis de infecção variável, alguns investigadores manter ratos sob anestesia por 30 minutos após inoculation10 transuretral. Após a cirurgia, os ratos deve se recuperar em um cobertor aquecimento limpo, com observação contínua para confirmar retorno dos padrões normais de respiração e atividade. Uma vez que os animais se recuperaram totalmente a capacidade de engatinhar, que podem ser devolvidos à cama contendo gaiolas.
III. CFU medição em tecido infectado
- Publicações diversas do mouse UTI relataram os resultados de cultura de 6 horas para uma semana ou mais após a inoculação. O tempo ideal pontos precisam ser determinadas empiricamente para cada combinação estirpe bacteriana / mouse. Urina anulada é obtido para a cultura por scruffing do mouse sobre uma placa de Petri estéril. Urina colhida deve ser mantida no gelo em todos os momentos. Várias tentativas para obter urina anulado durante muitas horas pode ser necessária, uma vez anular mouse é volume, freqüência baixa (3-10 microlitros por void), e estresse-dependente.
- Depois de obter amostras de urina anulada, nos sacrificamos camundongos usando isoflurano e deslocamento cervical. O abdômen é assepticamente aberto. Se uma amostra de urina anulado não foi obtida com sucesso anteriormente, uma pequena quantidade de urina muitas vezes pode ser aspirado através da parede da bexiga usando uma agulha de calibre 30 e seringa.
- Um ou ambos os rins são removidos, picadas em pelo menos 4 peças (cada peça deve ser inferior a 50 microgramas) em uma placa de Petri estéril e colocados em cordão de zircônio / PBS contendo criotubos no gelo. A bexiga é removida, picada em pelo menos 4 peças, e colocados em cordão de aço inoxidável / PBS contendo criotubos no gelo. O tecido / grânulo / PBS contendo criotubos são colocados em um homogeneizador de bala Blender e os tecidos são homogeneizados usando o "8" configuração de velocidade durante um minuto. É comum que alguns fragmentos de tecido para permanecer após homogeneização. Enquanto 5-10 microlitros de homogeneizado de líquido pode ser pipetado, fragmentos sólidosnão são necessariamente um problema. Se o tempo de homogeneização é o aumento de algumas amostras, é fundamental para fazê-lo para todos os tecidos, a fim de manter a consistência de homogeneização. Nós utilizamos uma bala Blender homogeneizador porque evita a possibilidade de contaminação cruzada, é mais rápido do que o processamento de amostras individuais um a um, usando um homogeneizador padrão, e não de forma significativa de calor as amostras sendo homogeneizado.
- Pelo menos dois ou três de dez diluições de urina coletados e homogeneizados de tecido deve ser feita em uma placa de microtitulação. Para experimentos preliminares, pode ser prudente para fazer pelo menos sete de dez diluições. Cultura até 100 microlitros de urina, da bexiga e / ou homogeneizados de rins em ágar apropriado. Uma vez que as amostras de urina podem ser de volume limitado, pode ser necessário para trazer os seus volumes de 100 microlitros antes de realizar dez diluições. Se esta for necessária, a diluição inicial (antes de dez vezes diluição) terão de ser tidos em conta os cálculos finais de rendimentos bacteriana. Nós preferimos UPEC cultura em eosina-azul de metileno ou agar MacConkey (incubação overnight a 37 ° C), uma vez que estes meios são seletivos para os organismos Gram negativos. Cepas UPEC crescer em agar MacConkey como central umbilicadas, vermelho-rosa colônias devido à sua capacidade para fermentar lactose.
- Depois de cultura durante a noite, contar o ufc para cada prato. Para amostras diluídas em série, a diluição placa contendo 50-100 colônias é considerada a contagem mais precisa. "Voltar" calcular ufc por tecidos, por miligrama de tecido, ou por ml.
IV. Resultados representante
Figura 1. Meato uretral (tecido rosa escuro) expostos, levantando capuz do clitóris cefálica com o fórceps (além topo da foto)
Figura 2. Cateterizada uretra. O clitóris bífido pode ser visto logo acima do cateter.
Figura 3. Bexiga ufc conta dois dias após a infecção transuretral de 8 semanas de idade do sexo feminino camundongos CBA / J com uropathogenic E. coli. Bexigas foram homogeneizadas e ufc / ml determinada pela diluição em série em ágar MacConkey. Diamantes indicam ufc / ml para camundongos individual, barra horizontal indica ufc mediana / ml.
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Discussion
Indução de rato infecção do trato urinário por inoculação de bactérias transuretral é um procedimento estabelecido há muito tempo, mas tecnicamente exigente 11. Hung e Hultgren publicou recentemente uma excelente revisão das técnicas de ressecção transuretral de mouse infecção do trato urinário 13. Neste trabalho, tentamos ilustrar ainda mais os pontos mais delicados desta abordagem experimental.
Novatos podem praticar a sua técnica através da realização de uma laparotomia mediana para expor a bexiga, a injeção de uma solução diluída de nanquim (1% em PBS), e observando a coloração azul da bexiga. Descobrimos que a bexiga cheia é um dos problemas mais difíceis de lidar durante a injeção do mouse uretral, e é melhor prevenida pela privação de água e as estratégias de pré-anestesia anulando descrito acima. Em nossas mãos, <10% dos camundongos apresentam excesso de urina durante a injeção uretral. Outro bloco potencial tropeço é o cateterismo traumático, que pode levar à perfuração da uretra, doses impróprias dos inóculos da bexiga, e até mesmo morte do animal. Técnica suave e paciência são fundamentais durante o cateterismo; cateterismo sucesso nunca deve exigir forçando o cateter na bexiga.
Finalmente, alguns laboratórios não pode querer usar uma bala Blender homogeneizador ou "throughput médio" outros homogeneizador, seja devido ao número baixo de amostra ou considerações de custo. Uma solução intermediária é usar um homogeneizador padrão e limpar o dispositivo entre cada amostra. A solução mais econômica é a utilização de vidro moedores, que nós empregada com sucesso antes de mudar para o Blender bala homogeneizador. Independentemente do método de homogeneização do tecido utilizado, técnica meticulosa de assepsia, e consistentes são cruciais para a obtenção de resultados reprodutíveis.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Shelly Xie e Jennifer Payne por sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi possível através de doações da Sociedade de Urologia Pediátrica e do Fundo de Investigação Pediátrica Stanford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
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