Summary
Denna video kommer att demonstrera metoder för att transurethrally framkalla mus urinvägsinfektioner och kvantifiera omfattningen av resulterande infektioner.
Abstract
Uropathogenic bakteriestammar av intresse odlas på agar. Generellt uropathogenic
Protocol
I. Förberedelse av urinröret katetrar
- För varje mus urinblåsa och njure som ska provtas, placera 5-6 rostfria kulor (urinblåsa, 1,6 mm storlek eller 0,9-2,0 mm blandning) eller zirkonium pärlor oxid (njure, 0,5 mm storlek) i en cryovial rör, respektive. Autoklav den pärla som innehåller rör.
- Efter att rören svalna till rumstemperatur, tillsätt 200 mikroliter sterilt PBS till varje rostfritt stål pärla som innehåller rör och 400 mikroliter av sterila PBS till varje zirkoniumoxid pärla som innehåller rör.
- Vi förbereder urinrörets katetrar som beskrivits av Hung och Hultgren 13. Autoklav en ren par platt-head pincett och fina sax (iris eller liknande) och låt instrumenten svalna till rumstemperatur. Torka av ytor i ett laminärt flöde huva med 70% etanol. I huven, skär ett 30 cm (ungefärliga) segment av polyeten slang. Aseptiskt placera en steril 30 gauge nål (1 / 2 tum lång nål) på en steril 3 cc spruta. Plocka upp ena änden av skär polyeten slang med autoklaveras pincett och dra slangen på nålen tills den möter navet. Skär av slangen så att ungefär 2 cm längre än spetsen på nålen. Ta bort katetern från sprutan och lägg i en steril petriskål.
- För att minska risken för korskontaminering, gör vi en kateter för varje mus. När alla katetrar är gjorda, sterilisera dem genom exponering i ett oskyddat petriskål för UV-strålning i minst 30 minuter. Titta inte direkt på UV-lampor eller utsätta någon del av kroppen i huven medan lamporna aktiveras. Efter UV-exponering, kan katetrar lagras långsiktigt i petriskål. Vi rekommenderar tätning skålen med Parafilm för att bibehålla sterilitet.
II. Animal Inokulering
- Möss bör anlända minst en vecka innan experimentell manipulation för att undvika stress-induced störfaktorer. Honmöss används eftersom den manliga musen urinröret är oerhört svårt att ANVÄNDA KATETER. CBA / J är ett allmänt används, UTI-känsliga inavlade musstam. Möss ska användas mellan 8 och 12 veckors ålder, eftersom det är fönstret av immunologiska mognad innan åldrande. Den första dagen av experimentet, doppa i slutet av en steril inokulering slinga in i en injektionsflaska av frysta bakteriell lager. Skrapa upp en liten inokulat och strimmig ut på en lämplig agarplatta. Generellt uropathogenic E. coli (UPEC) och andra stammar kan odlas över natten på Luria-Bertani (LB) agar vid 37 ° C i luften. UPEC stammar växa som fast, gulvita genomskinliga kolonier på LB agar. Omedelbart återlämna den bakteriella lager i frysen. Uropathogenic bakteriestammar kan bli mindre virulenta över tid med upprepade, seriella kulturer. Därför rekommenderar vi strimmor ut en ny agarplatta för varje experiment.
- På dag 2 av experimentet, efter att ha bekräftat riktig koloni morfologi, plocka enstaka kolonier från agar tallrikar och placera i minst 5 cc buljong kultur över en natt. LB buljong kan användas till de flesta uropathogenic bakteriestammar (37 ° C, 200 varv i luften). Håll lock löst på rören buljongen kulturen för att möjliggöra luftning.
- På dag 3 av experimentet, tar 10% av den första buljongen kultur och kultur i buljong igen över natten (vanligtvis 37 ° C och 200 rpm), för att förbättra typ I pili uttryck. Serial buljong kulturer bidrar till att optimera bakteriell uropathogenicity, eftersom typ I pili har visat sig vara en kritisk virulensfaktorn för uropathogens in vivo 1. Håll lock löst på rören buljongen kulturen för att möjliggöra luftning.
- På dag 4 av experimentet, mäta OD 600 av buljongen kultur från dag 3. Om det inte redan är kända för bakteriestam som testas, utför tio gånger seriell utspädningsplatt över minst 7 loggar (spädningar utförs med PBS, kulturer utförs på LB-agar, 37 ° C inkubering över natten) fastställa förhållandet mellan OD-600 och CFU / ml. Som en tumregel motsvarar en OD 600 av 0,4-0,5 vanligen till 1-2x10 7 cfu per 50 mikroliter. När förhållandet mellan OD-600 och cfu / ml har bestämts, kan man justera buljongen kulturen till OD 600 som motsvarar den önskade cfu per musen i 50 mikroliter PBS. En del arbete har föreslagit att ympning av 10 mikroliter, snarare än 50, leder till mindre reflux i kidneys6. Men de flesta publikationer rapporterat användning av 50 mikroliter per mus. Generellt önskat CFU varierar mellan 10 6 och 108 cfu / mus, men varje bakterie / musstam kombinationen måste empiriskt testas in vivo.
- För att säkerställa att inokulat inte annulleras omedelbart efter instillation, bör möss berövas vatten i minst 30 minuter före induktion av generell anestesi. En annan viktig manöver är att förmå tömning före anestesi induktion av scruffing möss och försiktigt trycka på den nedre abdomsv. Två till 2,5% isofluran är en säker induktionsdosen under 8-12 veckor gamla tik CBA möss, följt av underhåll av anestesi med 1,8-2% isofluran.
- När anestesi uppnås krävs möss placeras i liggande ställning med huvudet in i en nosecone ansluten till isofluran som innehåller syre. Den nedre delen av magen masseras att evakuera urin från blåsan. Om urinblåsan är relativt tom, kan denna manöver ge inte urin. Nedre delen av magen och perineum är indränkta med 70% etanol.
- En steril 1 cc spruta utan nål används för att utarbeta den önskade bakteriella inokulat. Därefter är en steril uretra kateter aseptiskt placeras på sprutan. Överskottet slangen är avskuren katetern med en sax så att bara 1-2 millimeter av slang kvar distalt om nålspetsen. Sedan är att sprutan knackade och kolven deprimerad med sprutan upprätt för att avlägsna alla bubblor. En klick bakteriostatisk glidmedel är sprutade på en steril petriskål eller insidan av steril spruta omslag. Spetsen på katetern (med bifogad spruta) doppas i gelé. Om flera bakteriestammar har testats i samma experiment, vara noga med att inte använda samma droppe gelé för att smörja katetrar som innehåller olika stammar.
- Med hjälp av en lupp (0,8 x till 5x zoomomfång) för förstoring, är klitoris den sövda musens försiktigt grepp i den icke-dominanta handen med ett par fintandad pincett och höjde cephalad att exponera den djupa rosa meatus uretrae ( Figur 1). Sprutan (med bifogad kateter) är fattade i den dominerande handen med en penna grepp och spetsen av katetern är engagerad i urinrörets meatus i 45 graders vinkel. Den klitoris är sträckt längs den långa axeln i sprutan, effektivt "loading" urinröret på katetern. Denna manöver är viktig eftersom musen urinröret är överflödig. Katetern ska glida lätt in i urinblåsan (upp till navet, figur 2), och kan försiktigt vred att hjälpa till att navigera i redundanta veck i urinröret. När katetern är hubbed kan sprutan sänkas tills det är parallellt med den långa axeln av musen. Den icke-dominanta hand kan släppa pincett för att stabilisera läget för kateter och spruta som den dominerande handen används för att långsamt injicera inokulatet (minst 5 sekunder). Om vätska syns flyter runt katetern under injektion, antingen blåsan helt eller att katetern i slidan (bara caudal till urinröret). Injektion bör omedelbart stoppas och ställning av katetern noggrant. Om katetern var i urinröret, bör ges musen inte ingå i experimentet. Å andra sidan kan en kateter felplacerad i slidan kan flyttas och injektionen nytt försök. Efter injektion är kateter och spruta långsamt tillbaka från musen.
- För att minska sannolikheten för tidigt efter ympning tömning, vilket kan evakuera administreras bakterier och därmed leda till varierande infektioner nivåer, vissa forskare ha möss under narkos i 30 minuter efter transuretral inoculation10. Efter operation, bör möss återhämta sig på ett rent värmande filt med ständig kontroll för att bekräfta tillbaka normal andning och aktivitet. När djuren helt har återhämtat sig förmågan att krypa, kan de skickas tillbaka till sängar som innehåller burar.
III. Att mäta CFU i infekterad vävnad
- Olika mus UVI publikationer har rapporterat om kulturen resultat från 6 timmar till en vecka eller längre efter ympningen. Den optimala tidpunkter måste bestämmas empiriskt för varje bakterie / musstam kombination. Annulleras urinen erhålls för kulturen genom scruffing musen över en steril petriskål. Insamlad urin bör hållas på is hela tiden. Flera försök att få annulleras urinen under många timmar kan det vara nödvändigt, eftersom musen tömning är frekvent, låg volym (3-10 mikroliter per void), och stress-beroende.
- Efter att ogiltigförklaras urin, offra vi möss med isofluran och halsdislokation. Buken är aseptiskt öppnas. Om ett ogiltigt urinprov inte framgångsrikt erhållits tidigare, kan en liten mängd urin ofta aspireras genom blåsväggen med en 30 gauge nål och spruta.
- En eller båda njurarna tas bort, malet till minst 4 bitar (varje del ska vara mindre än 50 mikrogram) i en steril petriskål och placeras i zirkonium pärlor / PBS som innehåller cryovials på is. Urinblåsan tas bort, malet i minst 4 stycken, och placeras i rostfritt stål pärla / PBS som innehåller cryovials på is. Vävnaden / pärla / PBS som innehåller cryovials placeras i en Bullet Blender homogeniseringsapparat och vävnader homogeniseras med "8" hastighetsinställning för en minut. Det är vanligt att en del vävnad fragment att stanna kvar efter homogenisering. Så länge som 50-100 mikroliter vätska homogenatet kan pipetteras, fast fragmentär inte nödvändigtvis ett problem. Om homogenisering tiden ökas för vissa prover, är det viktigt att göra så för alla vävnader i syfte att upprätthålla konsekvens i homogenisering. Vi använder en Bullet Blender homogeniseringsapparat eftersom det undviker risken för korskontamination, är snabbare än bearbetar enskilda prover en efter en med en vanlig homogeniseringsapparat, och inte signifikant värma proverna homogeniserade.
- Minst två eller tre tio-faldig spädningar av insamlade urin och homogenat vävnad bör ske i en mikrotiterplatta. För preliminära experiment kan det vara klokt att göra minst sju tio gånger spädningar. Kultur upp till 100 mikroliter urin, urinblåsan och / eller homogenat njure på lämpliga agar. Eftersom Urinprovet kan volym begränsad, kan det vara nödvändigt att ta med sig sina volymer till 100 mikroliter innan du utför tio gånger spädningar. Om detta krävs, kommer en initial spädning (före tiospädning) måste vägas in slutliga beräkningarna av bakteriell avkastning. Vi föredrar odling UPEC på eosin-metylenblått eller MacConkey agar (över natten inkubation vid 37 ° C), eftersom dessa medier är selektiva för gramnegativa organismer. UPEC stammar växer på MacConkey agar så centralt umbilicated, röd-rosa kolonier på grund av deras förmåga att jäsa laktos.
- Efter en natt kultur, räkna CFU för varje platta. För seriellt utspätt prov, är plattan utspädning innehåller 50-100 kolonier anses vara den mest exakta räknas. "Tillbaka" beräkna cfu per vävnad, per milligram av vävnad, eller per ml.
IV. Representativa resultat
Figur 1. Meatus uretrae (mörkrosa vävnad) exponeras genom att lyfta klitoris cephalad med pincett (utöver toppen av fotot)
Figur 2. Kateter urinröret. Den KLYVD klitoris kan ses strax ovanför katetern.
Figur 3. Urinblåsan cfu räknar 2 dagar efter transuretral infektion i 8 veckor gammal tik CBA / J möss med uropathogenic E. coli. Blåsor var homogeniserad och cfu / ml bestäms av seriell utspädning bordläggning på MacConkey agar. Diamanter indikerar cfu / ml för enskilda möss visar horisontellt streck median cfu / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Induktion av musen urinvägsinfektion genom transuretral inokulering av bakterier är en sedan länge etablerad, men tekniskt krävande förfarande 11. Hung och Hultgren publicerade nyligen en utmärkt genomgång av transuretral teknik för musen urinvägsinfektion 13. I denna skrift försöker vi att ytterligare belysa de finare detaljerna i denna experimentella strategi.
Nybörjare kan öva sin teknik genom att utföra ett mittlinjen laparotomi att exponera urinblåsan, injicera en utspädd lösning av tusch (1% i PBS), och observera för blåfärgning av urinblåsan. Vi har funnit att en full blåsa är en av de svåraste problemen att ta itu med under musen urinrör injektion och är bäst hindras av vattenbrist och pre-anestesi strategier för tömning beskrivs ovan. I våra händer, <10% av mössen uppvisar överflöd av urin under urinrörets injektion. En annan potentiell stötesten är traumatisk kateterisering, vilket kan leda till urinrörets perforering, felaktig doser av urinblåsan inokulat, och även djur död. Skonsam teknik och tålamod är viktiga vid kateterisering, framgångsrik kateterisering ska aldrig kräva tvingar kateter i urinblåsan.
Slutligen kan vissa laboratorier inte vill använda en Bullet Blender homogeniseringsapparat eller andra "medelhög genomströmning" homogeniseringsblandare, antingen på grund av låg provnummer eller med hänsyn till kostnaden. En tillfällig lösning är att använda en standard homogeniseringsapparat och rengöra enheten mellan varje prov. Den mest ekonomiska lösningen är användningen av glas slipmaskiner, som vi med framgång används före övergången till Bullet Blender homogeniseringsblandare. Oavsett vävnaden homogenisering metod som används, noggrann, aseptiska och konsekvent teknik är avgörande för att få reproducerbara resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Shelly Xie och Jennifer Payne för teknisk experthjälp. Detta arbete har gjorts möjlig genom bidrag från Society of Pediatric Urology och Stanford Pediatric Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
