Summary
כדי לבחון ביטוי גנים ברקמות הזרוע גלמי של Bicyclus anynana, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה של הכלאות באתרו באמצעות riboprobes. כמו כן אנו מספקים הנחיות אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול זה לשימוש כנפיים גלמי Lepidopteran של מינים אחרים.
Abstract
כאן אנו מציגים, בפורמט וידיאו, פרוטוקול של הכלאות באתרם גלמי כנפיים של פרפר Bicyclus anynana באמצעות riboprobes. ב הכלאות באתרו, עמוד התווך של הביולוגיה ההתפתחותית, מועילים כדי ללמוד את דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בפיתוח רקמות ברמה של שעתוק. אם נוגדנים היעד מוצרי חלבון של שעתוק הגנים טרם פותחו, ו / או יש גן עותקים מרובים של חלבון מסוים בגנום זה לא יכול להיות מובחן באמצעות נוגדנים זמינים, בכל מנח יכול לשמש במקום. בעוד בטכניקה באתרו עבור דיסקים כנף הזחל כבר זמין לקהילה פרפר במשך כמה שנים, פרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה עבור כנפי גלמי גדול יותר ועדין יותר.
Protocol
יום 1
- הכן את הפתרונות הבאים:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- הוסף DEPC עבור הנפח הכולל 0.1% ולנער פתרונות במרץ.
- החיטוי.
- Paraformaldehyde תקן 4% - באמצעות PBS-DEPC
- פתרון proteinase K - אם המשקע קיים, מערבולת במרץ לפני הסרת aliquot
- עצור הצפת עיכול
- Prehybridization הצפת
- 50:50 PBT: מאגר Prehybridization
- הכלאה הצפת
- פתרונות צריך להישמר RNase חינם. שימוש או כלי זכוכית, כי כבר אפוי (4 שעות 250 ° C) או פלסטיק חד פעמיות. Pipettes סרולוגית הם מאוד שימושי עבור ממציא פתרונות
- לנתח כנפיים מעת-מבוים גלמים ב PBS
- העבר כנפיים ישירות תקן הצפת בבארות של צלחת 24 תרבות היטב בטמפרטורת החדר
- תקן תקליטורי למשך 2 שעות
- לשטוף 5 x 5 דקות PBT
- דגירה כנפיים במשך 3 דקות בתמיסה K proteinase
- לשטוף 2 x ב הצפת עצור עיכול
- לשטוף 5 x 5 דקות PBT
- לשטוף 2 x 5 דקות 50:50 PBT: PHB
- שטפי 1 x 10 דקות PHB
- דגירה שעה לפחות 1 PHB על 55 ° C.
- חום לפגל RNA בדיקה (20-50ng לכל צורך היטב) (80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות) ולהוסיף למאגר הכלאה (100 μl הדרוש לכל טוב)
- הוספת בדיקה בארות דגירה 48 שעות ב 55 ° C
יום 3
- שטפי 4 x 5 דקות 55 ° C PHB
- דגירה לילה PHB ב 55 ° C
יום 4
- הכן את הפתרונות הבאים:
- בלוק נוגדן הצפת
- שטפי 1 x 5 דקות 50:50 PBT: PHB
- שטפי 4 x 5 דקות PBT
- כנפיים דגירה במשך שעה 1 ב הצפת בלוק ב 4 ° C
- דגירה כנפיים בדילול 1:2000 של נוגדנים נגד Dig לילה ב 4 ° C
יום 5
- הכן את הפתרונות הבאים:
- איתור הצפת
- פיתוח הפתרון - (לעטוף בנייר כסף) אור רגיש
- לשטוף 3 x 5 דקות PBT בטמפרטורת החדר
- לשטוף 7 X 5 דקות PBT
- לשטוף כנפיים פעמיים בתוך מאגר זיהוי
- פיתוח הכנפיים מ"ל 1 של פיתוח פתרון - זמן של התפתחות צריך להיות במעקב כל הזמן - פעמים מתפתחות יכול לשנות אפילו בעת שימוש חלליות אותו פתרון פיתוח - בדרך כלל לבדוק אחרי 5-10 דקות ולאחר מכן להגדיל את מרווחי עד לילה. פלייט יש לעטוף בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור כאשר לא בדיקת דגימות.
- לשטוף חמש פעמים הצפת עצור פיתוח
- הר כנפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אופטימיזציה של הפרוטוקולים הקיימים
ב הכלאות באתרם על דיסקים כנף הזחל בוצעו בהצלחה באמצעות דיסקים של פרפרים תמצית coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. ותרבי et al 1999).. הפרוטוקול הנוכחי הותאם מתוך פרוטוקול כתוב מפורט זמין על פי דרישה מן המעבדה קרול עבור stainings כנף הזחל. השינויים שעשינו לשרת כדי להכיל הבדלים בין רקמות כנף הזחל ו גלמי. במהלך והניתוחים hindwing גלמי, קרום peripodial יש להסיר ולא נכלל הבארות. הזמן לתקן הראשוני הוא הרבה יותר בפרוטוקול שלנו, אבל הצעד שלאחר התיקון הוסר. מצאנו כי דילול של פי 10 של הפתרון proteinase K היה צורך רקמות כנף שברירית גלמי תוך מתן לחדירה בדיקה מוצלחת. מצאנו גם כי חסימת כנפיים לפני מכתים נוגדן הקטינה באופן משמעותי את הרקע, בעוד הגדלת הדגירה נוגדנים לילה ב 4 ° C עלתה עוצמת האות.
יישומים
יישומים של פרוטוקול זה הן מגוונות. היכולת למקם את הביטוי של הגן מועמד על כנף גלמי בפיתוח יהיה הצעד הראשון לסבך את הגן הזה תפקיד פונקציונלי כלשהו במהלך הפיתוח דפוס כנף או כנף (מרקוס et al 2004;. ראמוס et al 2006).. אם מספר גנים שידוע כי הם אינטראקציה מערכות אחרות הם שיתוף הביע יחד על הכנפיים זה עלול לסבך את שיתוף האפשרות של יותר רשתות גנים ציון משוכלל של דפוסי כנף רומן (מונטיירו et al. 2006). כנף הפרפר דפוס Evo-Devo מספק מערכת עשירה שבה רלוונטי Evo-Devo שאלות הקשורות בתהליכי גנים רשת גנים שיתוף האפשרות, את האבולוציה של חידושים, את האבולוציה של תכונות מתכנסת ובמקביל, את האבולוציה של הומולוגיה טורית, ואת הגן שכפול משנה functionalization כולם יכולים להיות למד בצורה משולבת. יתר על כן, פרפרים להציג מגוון מבלבל של דפוסי האגף כי תפקיד הכרה המין, הברירה הזוויגית, חיקוי, thermoregulation, והימנעות טורף. הבנת גם את הבסיס הגנטי ואת ההתפתחות מאחורי דור של דפוסים אלה, כמו גם את הגורמים האקולוגיים כי לטובת דפוסים מסוימים יכולים להביא אותנו להבנה הוליסטית של התהליך האבולוציוני של הטיות ואילוצים המוטלים על תהליך זה על ידי מערכות התפתחותיות.
אופטימיזציה הנחיות הסתגלות מינים שונים
כאשר הסתגלות זו פרוטוקול כנפיים של מינים שונים, הדאגה העיקרית תהיה קבלת הרקמה חדיר לחקור את תוך שמירה על שלמות הרקמה. לכן, את השלבים ואת הקיבעון permeablization יהיה חייב להיות מותאם. עבור כנפיים גלמי Bicyclus, מצאנו כי תיקון 2 שעות בטמפרטורת החדר במאגר PFA טריים העיכול עדין K proteinase מספיק. רקמות יכול להיות קבוע עד 12 שעות ב -4 ° C אם יש צורך בכך אבל זה אפשרי לרקמות מעל לתקן את אשר תפחית אות, פעמים קיבעון כך קצר עדיפים. גם ריכוז האנזים ואת אורך, טמפרטורה של עיכול יש לקבוע באופן אמפירי על כל רקמה. הגיל של הכנפיים יכול להיות גם גורם משמעותי digestions כמו כנפיים מבוגרים יהיו מבנים cuticular לפרט יותר לאו דורשים עיכול ארוך יותר. חשוב לזכור כי K proteinase ההכנות זמינים מסחרית לא סטנדרטי עבור פעילות ספציפית, ולכן התנאים העיכול עשויים גם צריך להיות מותאם בעת שינוי המון. חדירות של רקמות יכול גם להיות מוגברת על ידי הדגירה בפתרונות חומרי ניקוי, למשל 1% Triton-X פתרון. זה יכול להיות צעד נוסף לקראת prehybridization.
חשש נוסף יהיה לייעל את גודל בדיקה, כלל האצבע להיות גדול יותר הוא טוב יותר. בוב ריד, אשר ביצע אגף גלמי מאוחר מנח ב Heliconius, הציע 300 נ"ב כגודל היעד (תקשורת אישית). חלליות גדולות יותר, מה שעשוי להגדיל את הספציפיות של האות, ניתן הידרוליזה לסייע כניסתם לתאים. במערכות אחרות, עם זאת, החוקרים משתמשים באופן שגרתי בדיקות 1 kb ללא hydrolyzing אותם. כאן היינו בדיקות מסביב 300bp וכן אשר עבד מצוין.
עבודה עם riboprobes יכול להיות מפחיד עבור מעבדות לא פעם RNA הטיפול. מצאנו בטכניקה זו כדי להיות חזקים למדי להכיל מספר צעדים למזער את אובדן החללית עקב פעילות RNase. עיכול K proteinase תסיר זיהום RNase ואת לפוראמיד 50% prehybridization / הכלאה מאגרים ימנע פעילות RNase (Chomczynski 1992). לכן, אנו מעודדים אנשים להשתמש riboprobes המגדילות את הספציפיות של האות והם לא מרתיעה כמו כמה עשויים לחשוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים ג'יין Selegue, מרגרט הולינגסוורת', ג'ין ברי, ריו Futahashi, Najmus סהר מחפוז, אלכסנדר Popadic, בוב ריד, תמיכה טכנית עבור רוש לסייע לפתרון בעיות בפרוטוקול זה. אנו מודים גם ויליאם Piel עצה על עריכת הסרט.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
