Summary
Al fine di esaminare l'espressione genica nel tessuto ala pupa di Bicyclus anynana, presentiamo un protocollo ottimizzato per ibridazioni in situ utilizzando riboprobes. Forniamo anche linee guida per l'ottimizzazione di questo protocollo per l'utilizzo in ali pupa di altre specie di lepidotteri.
Abstract
Qui vi presentiamo, in formato video, un protocollo per ibridazioni in situ in pupa ali della farfalla Bicyclus anynana utilizzando riboprobes. In ibridazioni in situ, un pilastro della biologia dello sviluppo, sono utili per studiare i modelli spaziali e temporali di espressione genica nello sviluppo di tessuti a livello della trascrizione. Se gli anticorpi che colpiscono i prodotti proteici di trascrizione del gene non sono ancora stati sviluppati, e / o ci sono copie del gene multiple di una particolare proteina del genoma che non possono essere differenziate utilizzando anticorpi disponibili, in situs può essere utilizzato in sostituzione. Mentre un a tecnica in situ per dischi ala larvale è stato a disposizione della comunità farfalla per diversi anni, l'attuale protocollo è stato ottimizzato per le ali più grandi e più fragile pupa.
Protocol
GIORNO 1
- Preparare le seguenti soluzioni:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- Aggiungi DEPC per lo 0,1% del volume totale e scuotere vigorosamente le soluzioni.
- Autoclave.
- Fix paraformaldeide 4% - con PBS-DEPC
- Soluzione di proteinasi K - presenza di un precipitato, vortice vigorosamente prima di rimuovere aliquota
- Digestione di arresto Buffer
- Prehybridization Buffer
- 50:50 PBT: Buffer Prehybridization
- Tampone di ibridazione
- Le soluzioni devono essere tenuti RNasi-free. Utilizzare vetro-ware che è stato cotto (4 ore a 250 ° C) o di plastica usa e getta. Pipette sierologiche sono molto utili per la confezione di soluzioni
- Sezionare le ali di volta in scena pupe in PBS
- Spostare le ali direttamente per risolvere il problema del buffer in pozzi di 24 piastra di coltura bene a temperatura ambiente
- Fissare i dischi per 2 ore
- Lavare 5 x 5 minuti in PBT
- Incubare le ali per 3 minuti in soluzione proteinasi K
- Sciacquare 2 x nel tampone digestione di arresto
- Lavare 5 x 5 minuti in PBT
- Lavare 2 x 5 minuti 50:50 PBT: PHB
- Lavare 1 x 10 minuti in PHB
- Incubare in PHB almeno 1 ora a 55 ° C.
- Calore denaturare l'RNA sonda (20-50ng necessari per pozzetto) (80 ° C per 5 minuti) e aggiungere al tampone di ibridazione (100 ul necessaria per pozzetto)
- Aggiungi sonda pozzi e incubare 48 ore a 55 ° C
3 ° GIORNO
- Lavare 4 x 5 minuti a 55 ° C PHB
- Incubare per una notte in PHB a 55 ° C
GIORNO 4
- Preparare le seguenti soluzioni:
- Anticorpi Block Buffer
- Lavare 1 x 5 minuti 50:50 PBT: PHB
- Lavare 4 x 5 minuti in PBT
- Ali incubare per 1 ora nel tampone di blocco a 4 ° C
- Incubare le ali in una diluizione 1:2000 di anticorpi anti-Dig notte a 4 ° C
GIORNO 5
- Preparare le seguenti soluzioni:
- Rilevamento buffer
- Soluzione di sviluppo - (avvolgere in pellicola) sensibile alla luce
- Lavare 3 x 5 minuti in PBT a temperatura ambiente
- Lavare 7 x 5 minuti in PBT
- Lavare le ali due volte nel tampone di rilevamento
- Sviluppare le ali in 1 ml di soluzione in via di sviluppo - il tempo di sviluppo deve essere monitorato di volta in volta - i tempi di sviluppo possono cambiare anche quando si utilizza la stessa sonda e la soluzione di sviluppo - in genere controllo dopo 5-10 minuti e quindi aumentare gli intervalli fino a notte. Piastra deve essere avvolto in un foglio per evitare l'esposizione alla luce quando non controllo di campioni.
- Risciacquare cinque volte nel tampone di arresto in via di sviluppo
- Montare ali.
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Discussion
Ottimizzazione dei protocolli esistenti
In ibridazioni in situ su dischi ala larvali sono stati effettuati con successo con i dischi da Précis farfalle coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. L'attuale protocollo è stato adattato da un protocollo dettagliato scritto disponibili su richiesta presso il Laboratorio Carroll colorazioni ala larvale. I cambiamenti che abbiamo fatto servono ad accogliere le differenze tra i tessuti ala larvale e pupale. Durante la pupa dissezioni hindwing, la membrana peripodial deve essere rimosso e non inclusi nei pozzetti. Il tempo di fix iniziale è molto più lungo nel nostro protocollo, ma il post-fix passo è stato rimosso. Abbiamo scoperto che un 10-diluizione della soluzione di proteinasi K era necessario per il tessuto fragile ala pupa pur consentendo la penetrazione della sonda di successo. Abbiamo anche trovato che il blocco delle ali prima della colorazione degli anticorpi molto ridotto di fondo, considerando che l'aumento degli anticorpi per l'incubazione overnight a 4 ° C maggiore potenza del segnale.
Applicazioni
Le applicazioni di questo protocollo sono molteplici. Essere in grado di localizzare l'espressione di un gene candidato su un'ala sviluppo pupale sarà il primo passo che coinvolgono questo gene in qualche ruolo funzionale durante modello di sviluppo ala o ala (Marcus et al 2004;. Ramos et al 2006).. Se diversi geni che sono noti per interagire in altri sistemi sono co-espressi insieme sulle ali questo può implicare la cooptazione di più reti geniche elaborati nella specificazione dei modelli di ala romanzo (Monteiro et al. 2006). Farfalla ala modello evo-devo fornisce un ricco sistema in cui pertinenti evo-devo questioni di processi di gene e la rete di geni cooptazione, l'evoluzione della novità, l'evoluzione dei tratti convergenti e paralleli, l'evoluzione di omologia seriale, e del gene duplicazione e sub-funzionalizzazione possono essere studiate in modo integrato. Inoltre, farfalle visualizzare una sconcertante varietà di modelli di ali che giocano un ruolo nel riconoscimento delle specie, la selezione sessuale, mimica, termoregolazione, ed evitare predatore. Comprendere sia le basi genetiche e di sviluppo dietro la generazione di questi modelli, come pure i fattori ecologici che favoriscono certi schemi ci può portare a una comprensione olistica del processo evolutivo e dei pregiudizi e dei vincoli imposti dai sistemi di questo processo di sviluppo.
Linee guida di ottimizzazione per l'adattamento a diverse specie
Momento dell'adeguamento di tale protocollo ali di specie diverse, la preoccupazione principale sarà rendere il tessuto permeabile alla sonda mantenendo l'integrità del tessuto. Pertanto, le fasi di fissazione e permeablization dovrà essere ottimizzato. Per Bicyclus ali pupa, abbiamo trovato che una soluzione 2 ore a temperatura ambiente in acqua dolce tampone PFA e un dolce digestione proteinasi K è sufficiente. I tessuti possono essere fissati fino a 12 ore a 4 ° C, se necessario, ma è possibile a un eccesso di riparare i tessuti che ridurrà del segnale, i tempi di fissazione in modo più brevi sono da preferire. Sia la concentrazione di enzima e la lunghezza e la temperatura di digestione devono essere determinate empiricamente per ogni tessuto. L'età delle ali può anche essere un fattore significativo nella digestioni come vecchie ali avranno cuticolare strutture più elaborate e anzi richiedono una digestione più lunga. E 'importante ricordare che i preparativi proteinasi K che sono disponibili in commercio non sono standardizzati per una specifica attività e, quindi, le condizioni di digestione potrebbe anche essere necessario un aggiustamento quando si cambia un sacco. La permeabilità dei tessuti può anche essere aumentata di incubazione in soluzioni detergenti, ad esempio un 1% Triton X-soluzione. Questo potrebbe essere aggiunta prima del passo prehybridization.
Un altro problema sarà quello di ottimizzare le dimensioni della sonda, regola generale di essere più grande è meglio. Bob Reed, che ha eseguito in ritardo ala pupa in situs in Heliconius, ha suggerito 300 bp come dimensione finale (comunicazione personale). Sonde più grandi, che possono aumentare la specificità del segnale, può essere idrolizzati per aiutare il loro ingresso nelle cellule. In altri sistemi, tuttavia, i ricercatori di routine usare 1 kb sonde senza idrolizzazione loro. Qui abbiamo utilizzato le sonde circa 300bp e che ha lavorato bene.
Lavorare con riboprobes può essere intimidatorio per i laboratori non utilizzati per l'RNA di movimentazione. Abbiamo trovato questa tecnica per essere abbastanza robusta e contenere diversi passaggi che riducano al minimo la perdita di sonda a causa di attività RNAsi. La digestione proteinasi K rimuove la contaminazione RNasi e la formammide 50% del prehybridization / ibridazione dei buffer inibire l'attività RNasi (Chomczynski 1992). Pertanto, invitiamo le persone ad utilizzare riboprobes che aumentano la specificità del segnale e non sono così scoraggiante come qualcuno potrebbe pensare.
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Acknowledgments
Ringraziamo Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche supporto tecnico per assistenza per la risoluzione di questo protocollo. Ringraziamo anche William Piel per consigli su come modificare il film.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
