Summary
Bicyclus anynanaの蛹の翼の組織における遺伝子発現を調べるために、我々はリボプローブを用いてサイチュハイブリダイゼーションのために最適化されたプロトコルを提示する。我々はまた、他のチョウ目の種の蛹の翼で使用するためにこのプロトコルのさらなる最適化のためのガイドラインを提供しています。
Abstract
ここでは、ビデオフォーマットで、リボプローブを使用して蝶Bicyclus anynanaの蛹の翼のサイチュハイブリダイゼーションのためのプロトコルを提示する。サイチュハイブリダイゼーションでは、発生生物学の主流は、転写レベルでの組織を開発する際に遺伝子発現の空間的および時間的パターンを研究するのに便利です。遺伝子の転写のタンパク質産物はまだ開発、および/または内臓で、入手可能な抗体を用いて区別することができないゲノムの特定のタンパク質の複数の遺伝子のコピーが存在していないターゲット抗体が代わりに使用することができる場合。幼虫の翼のディスクの現場テクニックで数年間、蝶のコミュニティに利用されていますが、現在のプロトコルは、より大規模で脆弱な蛹の翼のために最適化されています。
Protocol
1日目
- 以下のソリューションを準備します。
- 10倍PBS
- 1X PBS
- 1X PBT
- のddH 2 O
- 0.1パーセント合計ボリュームに対して、DEPCを追加し、積極的にソリューションを振る。
- オートクレーブ。
- 4％パラホルムアルデヒド修正 - PBS - DEPCを使用して
- プロテイナーゼK溶液 - アリコートを取り外す前に、精力的に沈殿物が存在する場合には、渦
- 消化ストップバッファー
- プレハイブリダイゼーションバッファー
- 50:50 PBT：プレハイブリダイゼーションバッファー
- ハイブリダイゼーションバッファー
- ソリューションは、RNaseフリーに保つ必要があります。どちら焼きされたガラスウエア（250で4時間° C）または使い捨てのプラスチックを使用してください。血清学的ピペットは、ソリューションを構成するために非常に便利です
- PBS中で蛹を上演時から翼を解剖する
- 室温で24穴培養プレートのウェルにバッファを修正するために直接翼を移動する
- 2時間のディスクを修正
- PBTで5 × 5分間洗浄
- プロティナーゼK溶液で3分間の翼をインキュベート
- 消化ストップバッファーで2 ×をすすぐ
- PBTで5 × 5分間洗浄
- PHB：50:50 PBTの2 × 5分間洗浄
- PHBの1 × 10分間洗浄
- 55 PHB少なくとも1時間のインキュベート℃の
- 熱変性RNAプローブ（20 - 50ngよくごとに必要な）（80℃で5分間）とハイブリダイゼーション緩衝液（100μlのウェル毎に必要）に追加
- ウェルにプローブを追加し、55℃で48時間インキュベート° C
3日目
- 55で4 × 5分間洗浄° C PHB
- 55 PHBで一晩インキュベート° C
4日目
- 以下のソリューションを準備します。
- 抗体のブロックバッファ
- PHB：50:50 PBTで1 × 5分間洗浄
- PBTで4 × 5分間洗浄
- 4のブロックバッファ内で1時間インキュベート翼は° C
- 一晩4抗DIG抗体の1:2000希釈で翼をインキュベート° C
5日目
- 以下のソリューションを準備します。
- 検出バッファー
- 現像液 - 敏感な光（ホイルでラップ）
- 室温でPBTの3 × 5分間洗浄
- PBTで洗浄7 × 5分
- 検出用バッファー中で翼を2回リンス
- ソリューションの開発の1 mlの翼を開発 - 開発の時間は、それぞれの時間を監視する必要がある - 時間を開発する同じプローブを使用してソリューションを開発する際にも変更できる - 一般的には一晩に間隔を増やしてから5-10分後にチェックして。プレートは、サンプルをチェックしない場合は光の暴露を防止するためにホイルで包まれるべきである。
- 開発停止バッファーで5回リンス
- 翼をマウントします。
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Discussion
既存のプロトコルの最適化
（。。らキーズ1999;。ウェザーら1999。キャロルら1994）幼虫の翼ディスクが正常にPRECIS coeniaの蝶からディスクを使用して実行されているのin situハイブリダイゼーション。現在のプロトコルは、幼虫の翼stainingsのためのキャロルの研究室からのリクエストも承ります詳細な書面によるプロトコルから適応されています。我々が行った変更は、幼虫と蛹の翅の組織の違いに対応するために役立つ。蛹hindwing解剖時には、peripodial膜を除去する必要がありますし、井戸に含まれていません。最初の修正の時間は、我々のプロトコルではるかに長いですが、事後修正のステップは削除されました。我々はまだ成功したプローブの浸透を可能にしながらプロティナーゼK溶液の10倍希釈が壊れやすい蛹の翼の組織のために必要であることがわかった。私たちは、一晩4℃で増加信号強度に抗体のインキュベーションを増加させるのに対し、抗体染色の前に翼をブロックして大幅にバックグラウンドを減少させることをもを発見した。
アプリケーション
このプロトコルのアプリケーションは多様です。開発蛹の翼上に候補遺伝子の発現をローカライズするためにできることは、翼や翼のパターン、開発中のある機能的な役割でこの遺伝子をimplicatingの最初のステップとなるだろう（マーカスら2004;。ラモスら、2006。）。他のシステムに作用することが知られているいくつかの遺伝子が翼を一緒に共発現している場合、これは小説翼のパターン（モンテイロら、2006）を指定することで、より精巧な遺伝子ネットワークの共同オプションを巻き込む可能性があります。ここで、遺伝子と遺伝子ネットワークの共同オプション、ノベルティの進化、収束及び平行形質の進化、シリアル同性の進化、および遺伝子ののプロセスを含む適切なEVO -ディーヴォの質問に蝶の翼のパターンEVO -ディーヴォは、豊富なシステムを提供します。重複やサブ機能化は、すべての統合された方法で調べることができる。また、蝶の種の認識、性選択、擬態、体温調節、そして捕食の回避に役割を果たす翼パターンの途方に暮れる様々な表示。これらのパターンの生成の背後にある遺伝と発達の基礎だけでなく、特定のパターンを好む生態的要因の両方を理解することは進化の過程の、発達のシステムによって、このプロセスに課されるバイアスや制約を総合的に理解するために私たちをもたらすことができます。
別の種への適応の最適化ガイドライン
異なる種の翼にこのプロトコルを適応する場合、主な関心事は、組織の整合性を維持しながら、プローブへの組織を透過していく予定です。したがって、固定とpermeablizationの手順では、最適化する必要があります。 Bicyclus蛹の翼のために、我々は、新鮮なPFAのバッファと穏やかなプロティナーゼK消化で、室温で2時間の修正が十分であることを発見した。組織を4℃、必要に応じてで12時間までの固定されたが、それは信号を低減するオーバーフィックス組織することが可能であることがありますので、短い固定時間が好ましい。酵素濃度と消化の長さと温度の両方がそれぞれの組織のために経験的に決定されるべきである。古い翼はより精巧なクチクラ構造を持っているし、いやもはや消化を必要とするように翼の年齢はまた消化に重要な要因となる可能性があります。その市販されているのProteinase Kの準備したがって、特定の活動のための標準化ではないと覚えておくことが重要である、消化の条件もたくさんの変更時に調整する必要があります。組織の透過性は、1％トリトン- Xソリューションは、例えば、洗剤の溶液中でインキュベートすることにより増やすことができます。これは、前のプレハイブリダイゼーションのステップに追加される可能性があります。
もう一つの懸念は、プローブのサイズを最適化することになります大きくなって一般的な目安としては優れています。 Heliconiusで内臓に遅く蛹の翼を実行したボブリードは、ターゲットのサイズ（私信）として300bpのを提案した。大規模なプローブは、シグナルの特異性を増加させる可能性が、細胞への進出を支援するために加水分解可能性があります。他のシステムでは、しかし、研究者が日常的にそれらを加水分解することなく、1 kbのプローブを使用してください。ここでは、問題なく動作だけでなく、300bp前後のプローブを使用していました。
リボプローブでの作業は、処理のRNAに使用されていないラボのために威圧することができます。我々は、かなり強固なものにし、RNase活性によるプローブの損失を最小限に抑えるいくつかの手順を含むようにこのテクニックを発見した。プロテイナーゼK消化はRNaseのコンタミを除去し、プレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーションバッファーの50％ホルムアミドは（Chomczynski 1992）RNase活性を阻害することになります。したがって、我々は、人々は、信号の特異性を高め、いくつか考えることができるほど威圧感はないリボプローブを使用することをお勧めします。
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Acknowledgments
私たちは、ジェーンSelegue、マーガレットホリングスワース、ジンベリー、亮Futahashi、NajmusサハルMahfooz、アレクサンダルPopadic、ボブリード、このプロトコルのトラブルシューティングに役立つためにロシュテクニカルサポートに感謝。我々はまた、ムービーの編集上のアドバイスをウィリアムピールに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
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