Summary
Um die Genexpression in den Puppenstadium Flügel Gewebe Bicyclus anynana untersuchen, stellen wir ein optimiertes Protokoll für in situ Hybridisierungen mit Ribosonden. Wir bieten auch Richtlinien für die weitere Optimierung des Protokolls für den Einsatz in Puppenstadium Flügel der andere Lepidopteren Arten.
Abstract
Hier präsentieren wir Ihnen im Video-Format, ein Protokoll für in situ Hybridisierungen in Puppenstadium Flügel des Schmetterlings Bicyclus anynana mit Ribosonden. In situ Hybridisierungen, sind eine tragende Säule der Entwicklungsbiologie, nützlich, um die räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression in Geweben entwickeln auf der Ebene der Transkription zu studieren. Wenn Antikörper, die das Protein Produkte der Gen-Transkription Ziel noch nicht entwickelt worden, und / oder gibt es mehrere Genkopien eines bestimmten Proteins in das Genom, die nicht differenziert werden können mit den verfügbaren Antikörper ist, kann in situs verwendet werden. Während eine in-situ-Technik für die Larven Flügel-Discs verfügbar war, um den Schmetterling Gemeinde seit mehreren Jahren hat sich die aktuelle Protokoll für die größeren und fragile Puppenstadium Flügel optimiert.
Protocol
TAG 1
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- ddH 2 O
- Add DEPC für 0,1% Gesamtvolumen und schütteln kräftig Lösungen.
- Autoclave.
- 4% Paraformaldehyd Fix - mit PBS-DEPC
- Proteinase K-Lösung - wenn Niederschlag vorhanden ist, Vortex kräftig, bevor Sie aliquoten
- Verdauung Anschlagpuffer
- Prähybridisierungspuffer
- 50:50 PBT: Prähybridisierungspuffer
- Hybridisierungspuffer
- Lösungen sollten gehalten RNase-frei sein. Verwenden Sie entweder Glas-ware, die gebacken hat (4 Stunden bei 250 ° C) oder Einweg-Kunststoff. Serologische Pipetten sind sehr nützlich für die Herstellung von Lösungen
- Dissect Flügel von Zeit inszenierte Puppen in PBS
- Bewegen Flügel direkt auf Buffer in Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatte Fix bei Raumtemperatur
- Fix-Discs für 2 Stunden
- Wash 5 x 5 Minuten in PBT
- Inkubieren Flügel für 3 Minuten in Proteinase K-Lösung
- Spülen Sie 2 x in der Verdauung Anschlagpuffer
- Wash 5 x 5 Minuten in PBT
- Wash 2 x 5 Minuten in 50:50 PBT: PHB
- Wash 1 x 10 Minuten in PHB
- Inkubieren in PHB mindestens 1 Stunde bei 55 ° C.
- Heat-denaturieren RNA-Sonde (20-50ng pro Well benötigt) (80 ° C für 5 Minuten) und fügen Sie Hybridisierungspuffer (100 ul pro Well benötigt)
- Add-Sonde in die Vertiefungen und inkubieren 48 Stunden bei 55 ° C
TAG 3
- Wash 4 x 5 Minuten in 55 ° C PHB
- Inkubieren über Nacht in PHB bei 55 ° C
TAG 4
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen:
- Antikörper Blockpuffer
- Wash 1 x 5 Minuten in 50:50 PBT: PHB
- Wash 4 x 5 Minuten in PBT
- Inkubieren Flügeln für 1 Stunde in Blockpuffer bei 4 ° C
- Inkubieren Flügel in einer 1:2000 Verdünnung von Anti-Dig-Antikörper über Nacht bei 4 ° C
TAG 5
- Bereiten Sie folgende Lösungen:
- Erkennung Buffer
- Entwickeln Solution - lichtempfindlich (wrap in Folie)
- Wash 3 x 5 Minuten in PBT bei Raumtemperatur
- Wash 7 x 5 Minuten in PBT
- Spülen Flügel zwei Mal in Detektionspuffer
- Develop Flügel in 1 ml der Entwicklung Solution - Zeit der Entwicklung muss jedes Mal kontrolliert werden - die Entwicklung von Zeiten können auch geändert werden, wenn die gleichen Sonden-und Entwicklungsländern Lösung - in der Regel nach 5-10 Minuten zu überprüfen und dann zu erhöhen Abständen bis zu übernachten. Platte sollte in Folie gewickelt werden, um Belichtung zu verhindern, wenn nicht die Überprüfung von Proben.
- Spülen Sie fünf Mal in Entwicklungsländern Anschlagpuffer
- Berg Flügel.
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Discussion
Optimierung bestehender Protokolle
In situ Hybridisierungen auf Larven Flügel Scheiben erfolgreich durchgeführt wurden mit Scheiben aus Precis coenia Schmetterlinge (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. Das derzeitige Protokoll hat sich von einer ausführlichen schriftlichen Protokoll auf Anfrage von der Carroll Lab für die Larven Flügel Färbungen angepasst. Die Veränderungen, die wir gemacht dienen, um Unterschiede zwischen Larven-und Puppenstadium Flügel Gewebe aufnehmen. Während Puppenstadium Hinterflügel Dissektionen, sollte die peripodial Membran entfernt und werden nicht in den Brunnen. Die erste fix Zeit ist viel mehr in unserem Protokoll, aber die Post-fix Schritt entfernt worden ist. Wir fanden, dass ein 10-facher Verdünnung der Proteinase K-Lösung, die für die fragile Puppenstadium Flügel Gewebe, während immer noch eine erfolgreiche Sonde Penetration wurde. Wir fanden auch, dass die Blockierung der Flügel vor Antikörper-Färbung stark Hintergrund reduziert, während die Erhöhung der Antikörper-Inkubation über Nacht bei 4 ° C erhöht die Signalstärke.
Anwendungen
Die Anwendungen dieses Protokolls sind vielfältig. Die Möglichkeit zur Lokalisierung der Ausdruck eines Kandidaten-Gen auf einem Entwicklungsland Puppenstadium Flügel wird der erste Schritt sein in Verwicklung dieses Gen in einigen funktionelle Rolle bei der Flügel-oder Flügel-Muster Entwicklung (Marcus et al 2004;. Ramos et al 2006).. Wenn mehrere Gene, die bekanntermaßen in anderen Systemen zu interagieren, sind zusammen auf den Flügeln koexprimiert dies die Kooptierung von aufwendiger Gen-Netzwerke in der Angabe Roman Flügel Muster implizieren (Monteiro et al. 2006). Schmetterlingsflügel Muster Evo-Devo bietet ein reiches System, in dem einschlägige Evo-Devo Fragen rund um die Prozesse der Gen-und Gen-Netzwerk co-option, die Entwicklung von Neuheiten, die Entwicklung von konvergenten und parallel Züge, Gen die Entwicklung der seriellen Homologie und der Vervielfältigung und sub-Funktionalisierung können alle in einer integrierten Art und Weise untersucht werden. Darüber hinaus zeigen Schmetterlinge eine verwirrende Vielfalt von Flügel-Muster, die eine Rolle in der Art Anerkennung, sexuelle Selektion, Mimik, Thermoregulation und Raubvermeidung spielen. Verständnis sowohl die genetischen und Entwicklungsstörungen Basis hinter der Generation dieser Muster, sowie die ökologischen Faktoren, die bestimmte Muster für uns zu einem ganzheitlichen Verständnis der evolutionären Prozesses und der Vorurteile und Zwänge auf diesen Prozess, indem Entwicklungs-Systeme auferlegt zu bringen.
Optimierung Richtlinien für die Anpassung an unterschiedliche Arten
Bei der Anpassung dieses Protokoll zu den Flügeln der verschiedenen Arten, die Hauptanliegen machen das Gewebe durchlässig für die Sonde unter Beibehaltung der Integrität des Gewebes. Daher wird die Fixierung und Permeabilisierung Schritte müssen optimiert werden. Für Bicyclus Puppenstadium Flügel, haben wir festgestellt, dass ein 2 Stunden fix bei Raumtemperatur in frischer PFA-Puffer und eine sanfte Proteinase K Verdauung ausreichend ist. Gewebe der bis zu 12 Stunden behoben werden bei 4 ° C, wenn nötig, aber es ist möglich, über-fix Gewebe, das Signal zu reduzieren wird, sind so kürzer Fixierung Zeiten bevorzugt. Sowohl die Enzymkonzentration und die Länge und die Temperatur der Verdauung sollte empirisch für jedes Gewebe bestimmt werden. Das Alter der Flügel kann auch ein bedeutender Faktor bei der Verdauung als ältere Flügel aufwendiger cuticulare Strukturen haben wird, und ja eine längere Verdauung. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Proteinase K Zubereitungen, die im Handel erhältlich sind nicht standardisiert sind für eine bestimmte Tätigkeit, und daher kann die Verdauung Bedingungen müssen auch angepasst werden, wenn wechselnden viel werden. Die Durchlässigkeit des Gewebes kann auch durch Inkubation in Reinigungslösungen erhöht werden, zum Beispiel eine 1% Triton-X-Lösung. Dies könnte vor dem Prähybridisierung Schritt hinzugefügt werden.
Ein weiteres Anliegen wird es sein, Sonde Größe zu optimieren, wird Faustregel wird größer auch besser. Bob Reed, der späten Puppenstadium Flügel durchgeführt hat in situs in Heliconius, schlug 300 bp als Zielgröße (persönliche Mitteilung). Größere Sonden, die die Spezifität des Signals zu erhöhen, kann hydrolysiert werden, um ihren Eintritt in die Zellen zu unterstützen. In anderen Systemen, aber Forscher routinemäßig 1 kb-Sonden ohne hydrolysiert. Hier haben wir Sonden um 300bp sowie die feinen gearbeitet.
Arbeiten mit Ribosonden kann für Labors nicht auf den Umschlag RNA verwendet werden einschüchternd. Wir haben diese Technik erwies sich als recht robust und in mehreren Schritten, dass der Verlust der Sonde durch RNase-Aktivität zu minimieren enthalten. Die Proteinase K-Verdau wird entfernt RNase Kontamination und die 50% Formamid der Prähybridisierung / Hybridisierungspuffer wird RNase-Aktivität zu hemmen (Chomczynski 1992). Daher ermutigen wir die Menschen Ribosonden, welche die Spezifität des Signals zu erhöhen verwenden und sind nicht so schlimm, wie manche denken.
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Acknowledgments
Wir danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche Technical Support, um Hilfe bei der Fehlersuche dieses Protokoll. Wir danken auch William Piel um Rat bei der Bearbeitung des Films.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
