Summary
Toxoplasma gondii ממיר כדי ליצור ציסטה בתגובה מדגיש סביבתיים, אשר ניתן חיקה במודלים של תרביות רקמה. וידאו זה מדגים טכניקות כדי לבחון הקמת קיר הציסטה על ידי הפעלת מח עצם הנגזרות מקרופאגים או שינוי בינוני צמיחה pH בתאים פיברובלסטים.
Abstract
Toxoplasma gondii הוא טפיל תאיים לחייב שניתן לפלוש בכל תא גרעיני של דם חם לבעלי חיים. במהלך זיהום, ט gondii מפיצה כמו צורה שכפול מהיר שנקרא tachyzoite. Tachyzoites להמיר לצורה הגדלים לאט encysted שנקרא bradyzoite בתהליך מאותת כי לא מאופיין היטב. בתוך בעלי חיים, ציסטות bradyzoite נמצאים במערכת העצבים המרכזית ורקמות שרירים מייצגים את שלב כרוני של זיהום. הסבת bradyzoites ניתן לדמות בתרבות רקמה ברעב CO 2, באמצעות מדיום עם pH גבוה, או תוספת של אינטרפרון גאמה (IFNγ). Bradyzoites מאופיינים על ידי נוכחות של קיר הציסטה, אשר לקטינים לבלב biflorus agglutinin (DBA) נקשר. DBA שכותרתו fluorescently משמש כדי להמחיש את קיר הציסטה ב טפילים הגדלים fibroblasts העורלה האדם (HFFs) כי נחשפו CO 2 נמוך ובינוני pH גבוה. באופן דומה, טפילים המתגוררים מח עצם Murine הנגזרות מקרופאגים (BMMs) להציג קיר הציסטה לזיהוי על ידי DBA לאחר BMMs מופעלים עם IFNγ ו lipopolysaccharide (LPS). פרוטוקול זה יהיה להדגים כיצד לגרום ההמרה של ט ' gondii כדי bradyzoites באמצעות מדיום הגידול pH גבוה עם CO 2 הפעלה נמוך של BMMs. תאים מארח יהיה מתורבת על coverslips, נגוע tachyzoites והופעל גם עם תוספת של IFNγ ו LPS (BMMs) או חשיפה בינונית צמיחה גבוה pH (HFFs) במשך שלושה ימים. עם השלמת זיהומים, התאים המארחים יהיה קבוע, permeabilized, וחסמו. קירות הציסטה יהיה דמיינו באמצעות DBA rhodamine עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Protocol
1. הכנת fibroblasts העורלה האדם (HFF) מצופה coverslips
- מניחים coverslip סטרילי זכוכית עגול בחלק התחתון של הבארות של צלחת 24 גם בתרבית רקמה.
- כדי לקצור HFFs מתוך בקבוקון ומחוברות 2 150cm, לשטוף את הבקבוק פעמיים עם 1X PBS ומוסיפים 2.5 מ"ל של 0.025% טריפסין-EDTA. דגירה בקבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
- את הצד הקשה של הבקבוק על כף היד שלך יכול לסייע ניתוק התאים מהבקבוק. לאחר התאים שוחרר מהבקבוק, מוסיפים 150 מ"ל של HFF בינוני (השתנה Dulbecco הנשר בינוני [DMEM] עם 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין ו -1% לפניצילין, סטרפטומיצין) ולהשתמש בינוני לשטוף את הבקבוק ולאסוף התאים.
- לוותר על 1 מ"ל של תאים לכל היטב עם coverslips.
- אפשר להפוך תאים ומחוברות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
2. הכנת L929 בינוני מותנה (CM) של BMC פיתוח
- L929 הוא aneuploid Murine fibrosarcoma תא הקו מפריש המושבה macrophage מגרה גורם לאחר תקופות ארוכות של confluency. הפרשה זו מאפשרת ס"מ L929 התאים לשמש לפיתוח תאים במח העצם עכבר מקרופאגים לתוך התרבות תאים 1.
- לאחר L929 תאים ומחוברות, לתת להם לדגור על 7-9 ימים נוספים עד שהם מופיעים כדורי ולהתחיל להרים את הבקבוק. איסוף supernatant ו גלולה כל התאים מנותקת XG ב 425 במשך 10 דקות. Supernatant זהו CM.
- אחת 150 2 ס"מ בקבוק של L929 תאים התשואות 30 מ"ל של CM, אשר מייצר 150 מ"ל של מדיום BMC. BMC בינוני מורכב 10% FBS, CM 20%, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו -1% ב-L-גלוטמין DMEM.
3. בידוד של מח עצם תרבית תאים של BMCs
- להקריב C57BL / 6 העכבר בחנק CO 2 משטח לחטא עם אתנול 70%.
- לחשוף את הצפק על ידי הרמת עור הבטן ליד הרגל גזירה במספריים. הימנע ניקוב חלל הצפק. צמצמו את הרגל על מנת לחשוף את עצם השוק לבין עצם הירך. גזור רקמת שריר מן העצמות ברגל באמצעות מספריים.
- כדי להסיר את עצם הירך, חתך פעם מתחת לברך, ופעם ליד הירך. מניחים את העצמות בצלחת פטרי בקטריולוגית המכיל קר 1X PBS. אין להשתמש בתרבית רקמה שטופלו צלחות פטרי על צעדים אלה, משום BMCs תדבק לצמיתות. השתמש באזמל כדי לגרד רקמת שריר נוספת. חותכים את העצם בדיוק מעל הברך כדי לחשוף את מח.
- חזור על שלבים (ב) ו - (ג) כדי לאסוף את מח העצם של הירך השנייה.
- השתמש מזרק 10cc מלאים קר 1X PBS ומחט 25 מד כדי לסלק את מח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. עצם אמור להופיע פעם לבן טהור מוח מוסר.
- לעבור את התערובת PBS / 22 מח באמצעות מחט מד לשבור את כל אגרגטים מח עצם.
- ספין את התערובת על XG 425 במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant.
- Resuspend גלולה ב 8 מ"ל של מדיום BMC. הוסף 1 מ"ל של השעיה התא 9 מ"ל BMC בינוני עד 8 צלחות פטרי בקטריולוגית.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- ביום 5, להוסיף 10 מ"ל בינוני BMC על כל צלחת. ביום 7, התאים יפותח במלואו. BMCs ניתן passaged במשך 1-2 שבועות לאחר ההבשלה.
- כדי לפצל BMCs, להסיר את בינוני ומוסיפים 5 מ"ל של קר 1X PBS על כל צלחת פטרי. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, עד שהתאים מתחילים להרים. שוטפים את BMCs מהצלחת עם טפטפת העברת סטרילית.
- בריכת BMCs בצינור חרוטי 50 מ"ל ו גלולה בשעה XG 425 במשך 10 דקות.
- Resuspend גלולה במדיום 10 מ"ל ו - BMC לסמוך hemocytometer. 2x105 Seed BMCs היטב לכל צלחת 24 גם עם coverslips זכוכית עגול על התחתונה. בואו BMCs לדבוק לילה לפני הדבקה עם ט ' gondii. BMCs עודף ניתן reseeded על צלחות פטרי לשימוש מאוחר יותר.
4. מדביק תאים עם ט ' gondii
- להדביק 25 ס"מ 2 בקבוק של HFFs ומחוברות עם 2x10 6 ט gondii ולגדול עד התאים מתחילים lyse (כ 2-3 ימים).
- השתמש מגרד תא להסיר את monolayer נגוע התא המארח מהבקבוק בתרבית רקמה מכן שחרר את הטפילים מן התאים לארח על ידי העברת monolayer וחילצה באמצעות מחט 27-מד.
- השתמש hemocytometer כדי לקבוע את מספר טפילים במדיום.
- להדביק 10 5 טפילים לכל היטב עם coverslip של HFF monolayers מ 1 לפרוטוקול, או BMCs מן הפרוטוקול 3. בואו הטפילים לפלוש במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
5. ייזום ט gondii bradyzoite פיתוח על ידי לחצים סביבתיים
- Bradyzoite פיתוח HFFs עם עלייה pH בינוני 2 CO רעב
- הכן בינוני פיתוח. פיתוח בינוני מכיל RPMאני 1640 בלי סודה לשתייה, 1% FBS, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו 42 HEPES מ"מ. pH 8.0 כדי לעקר ולסנן.
- הסר DMEM מ HFFs נגועים, יש לשטוף עם 1X PBS, ולהוסיף 1ml של התפתחות המדיום.
- דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם הסביבה האוויר.
- הפעלת BMCs
- הכן בינוני להפעיל BMCs. בינוני ההפעלה היא מדיום BMC בתוספת 100U/ml IFN-γ ו - 100 ng / ml LPS. Sonicate LPS באמבט מים למשך 2 דקות לפני השימוש כדי לשבש אגרגטים.
- הסר BMC בינוני מבארות ולהחליף עם 1 מ"ל של מדיום ההפעלה.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 ימים.
6. Immunofluorescence זיהוי
- לשטוף נגוע בארות שלוש פעמים עם 1X PBS.
- תקן את monolayer עם 200ul של פורמלדהיד 3% למשך 20 דקות.
- הסר מקבע ולשטוף בארות עם 1X PBS.
- הוסף 200μl של 0.1 M גליצין לבארות ולתת לשבת במשך 5 דקות.
- הסר גליצין ולשטוף בארות עם 1X PBS.
- הוסף 250 μl של 3% BSA/0.2% TritonX-100 ב 1X PBS כדי permeabilize ולחסום את monolayer במשך 30 דקות.
- הסר פתרון חסימת ולשטוף בארות עם 1X PBS.
- הוסף 50 μl של דילול 1:250 של rhodamine לבלב biflorus agglutinin ב 3% BSA/0.2% Triton X-100 ב 1X PBS.
- מכסים בצלחת ומניחים על מצע שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה 1
- שטפו את coverslips 3 פעמים עם 0.2% Triton X-100 ב 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד על שייקר פלטפורמה.
- Coverslips הר באמצעות מדיום VectaShield הרכבה המכיל 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- ויטראז ט gondii ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן מתאים עבור rhodamine בהגדלה של 100x.
7. נציג תוצאות
איור 1 מציג DBA נציג מכתים של ט ' gondii ב BMMs ו HFFs מופעל תחת לחץ pH. שני DBA להראות מכתים סביב טפיל המכיל vacuoles, המעידים על נוכחות של מרכיבים קיר הציסטה. התמונה BMM מופעל מראה מכתים DBA העולה בקנה אחד עם פני השטח של vacuole. חתך של ט ' gondii ב-pH הדגיש HFFs מציגה את קיר הציסטה ללא מבנים פנימיים מוכתם.
באיור 1. DBA מכתים של ט הדגיש gondii. טפילים תאיים בתנאי סטרס, BMMs מופעל או pH הדגיש HFFs, הוכתמו DBA מצומדות rhodamine (אדום). הפרעה דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מציגה את קווי המתאר של ציסטה לבין בר סולם שחור שווה 2 מיקרומטר.
לניסויים בבעלי חיים
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת ויסקונסין Animal Care ועדת שימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד מנגנון הפיתוח bradyzoite לא מובנת לחלוטין, מנתח גנטיקה מולקולרית של ט ' המרה gondii הבמה בתרבות רקמה הובילה לגילוי של גנים המעורבים ביצירת ציסטה bradyzoite 2,3,4. מנתח הוביל גם תצפית שכמה סמנים bradyzoite באים לידי ביטוי אחרים בתנאי עקה מתמשך, כולל גידול מקרופאגים מופעל 5,6. השיטות לעיל לתאר איך לגדל ט gondii ולגרום להתפתחות קיר DBA חיובי ציסטה מבנה בשתי BMCs ו HFFs. תוצאות אלו מדגישות כי מסלול התפתחות ציסטה יכול להיגרם על ידי גירויים שונים מתח.
בגלל ט gondii יכול לגדול כמעט בכל תא גרעיני של דם חם המארחים, סוגי תאים רבים ניתן להשתמש כדי לגדול ט gondii במבחנה. HFFs שימשו פרוטוקול זה כי הם קשר עכבות קו התא. מאז תרבית תאים פיתוח bradyzoite לוקח שלושה ימים, קל יותר להשתמש שורות תאים כי לא לגדול יותר. HFFs הם תאים ראשוניים כי לא יכול להיות מתורבת ללא הגבלת זמן. HFFs עוד הם passaged בתרבית רקמה, סובלנית פחות הם הופכים למדיום pH גבוה, ולכן הם הופכים להיות פחות שמיש למעבר bradyzoite. לקבלת תוצאות אופטימליות, התאים המארח צריך להיות מעבר נמוך מותר לנוח לפחות שבוע אחרי ונעשה ומחוברות. ישנן שיטות חלופיות גרימת פיתוח bradyzoites כי יש השפעות שונות על התא המארח 7.
ט gondii משגשג הרבה סוגי תאים חיסוניים. עבור יישומים מסוימים, BMCs עדיפים על macrophage שורות תאים כי הם נמנעים חפצים שעשויים הוכנסו על ידי הנצחה 8. BMCs שימושיים גם בניסויים במבחנה כי יש להם מורפולוגיה שטוח לעומת RAW264.7 תאים, מה שהופך אותם נוחים יותר מיקרוסקופית. השיטה תרבות בסיסיים BMC המתואר כאן ניתן להתאים לצרכים אחרים, לרבות ייצור של BMCs מן זנים אחרים עכבר 9,10. מידת הפעלת ראיתי עם IFNγ ו LPS עשוי להשתנות בהתאם לספק ואפילו הרבה. לכן צריך לכיל סכומי LPS ו IFNγ להשתמש במדיום הפעלה עבור ביצועים מיטביים עקבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ויסקונסין במדיסון הרמן א 'שפירו נכבדים בוגרת מלגת (CMT), פרס NIH AI072817 (AMP) ו - American Heart Association פרס 0840059N (LJK).Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
| L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W.
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
