Summary
Toxoplasma gondii omvandlas till en cysta formulär som svar på miljöpåfrestningar, som kan härmade i modellerna vävnadsodling. Denna video visar tekniker för att undersöka cysta väggen bildas genom att aktivera härledd från benmärg makrofager eller ändrar pH-tillväxt medium fibroblast celler.
Abstract
Toxoplasma gondii är en obligat intracellulär parasit som kan invadera alla kärnförsedda cell i varmblodiga djur. Under infektion, T. gondii sprider som en snabb replikering formulär som kallas tachyzoite. Tachyzoites konvertera till en långsamt växande encysted formen kallas bradyzoite genom ett signalsystem process som inte är väl karakteriserade. Inom djur, bradyzoite cystor finns i det centrala nervsystemet och muskelvävnad och representerar den kroniska skedet av infektionen. Konvertering till bradyzoites kan simuleras i vävnadskultur av CO 2 svält, med hjälp av medium med högt pH-värde, eller tillägg av interferon-gamma (IFNγ). Bradyzoites kännetecknas av närvaron av en cysta vägg, som lektin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binder. Fluorescerande DBA används för att visualisera cysta väggen i parasiter odlas i humana förhuden fibroblaster (HFFs) som har utsatts för låga CO 2 och högt pH medium. Likaså parasiter som bor i murina härledd från benmärg makrofager (BMMs) visa en cysta väggen upptäckas av DBA efter BMMs aktiveras med IFNγ och lipopolysackarid (LPS). Detta protokoll kommer att visa hur man kan få konvertering av T. gondii till bradyzoites med en hög medium pH tillväxt med låg CO 2 och aktivering av BMMs. Värdceller kommer att odlas på täckglas, infekterade med tachyzoites och antingen aktiveras med tillägg av IFNγ och LPS (BMMs) eller utsätts för högt pH tillväxt medium (HFFs) i tre dagar. Efter avslutad infektioner, kommer värdceller fastställas, permeabilized, och blockerade. Cysta väggar kommer att visualiseras med Rhodamine DBA med fluorescensmikroskopi.
Protocol
1. Beredning av mänskliga förhuden fibroblaster (HFF)-belagda täckglas
- Placera en steril runda glas täckglas på botten av brunnarna i ett 24-och vävnadsodling plattan.
- Att skörda HFFs från en konfluenta 150cm 2 kolv, skölj kolven två gånger med 1X PBS och tillsätt 2,5 ml 0,025% trypsin-EDTA. Inkubera kolv vid 37 ° C i 5-10 minuter.
- Genom att peka på sidan av kolven mot handflatan kan stöd i loss celler från kolven. När celler har släppt från kolven, tillsätt 150 ml HFF medium (Dulbecco ändrade Eagle Medium [DMEM] med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, och 1% penicillin-streptomycin) och använder mediet för att skölja kolven och samla cellerna.
- Tillsätt 1 ml av celler per brunn med täckglas.
- Låt celler att bli sammanflytande vid 37 ° C, 5% CO 2.
2. Förbereda L929 betingad medium (CM) för BMC utveckling
- L929 är en mus aneuploid fibrosarkom cellinje som utsöndrar makrofag kolonistimulerande faktor efter långa perioder av confluency. Denna utsöndring möjliggör cm från L929 celler som skall användas för att utveckla mus benmärgsceller i makrofager i cellkultur 1.
- När L929 celler konfluenta, låt dem inkubera under ytterligare 7-9 dagar innan de visas sfäriska och börjar lyfta av kolven. Samla supernatanten och pellets någon fristående celler vid 425 xgi 10 minuter. Detta supernatanten GH.
- Ett 150 cm 2 kolv L929 celler ger 30 ml cm, vilket ger 150 ml BMC medium. BMC mediet består av 10% FBS, 20% cm, 1% penicillin-streptomycin, och 1% L-glutamin i DMEM.
3. Isolering av benmärgen och cellodling av BMCs
- Offra en C57BL / 6 mus av CO 2 kvävning och yta sterilisera med 70% etanol.
- Exponera bukhinnan genom att lyfta bukhuden nära benet och skära med sax. Undvik att punktera bukhålan. Skär ner på benet för att exponera skenbenet och lårbenet. Klipp muskelvävnad från benet ben med sax.
- För att ta bort lårbenet, klippa gång under knäet och en gång nära höften. Placera benen i en bakteriologisk petriskål med kallt 1X PBS. Använd inte vävnadsodling behandlas petriskålar för dessa steg eftersom BMCs kommer att hålla sig permanent. Använd en skalpell för att skrapa bort extra muskelvävnad. Skär av benet strax ovanför knät att exponera märgen.
- Upprepa steg (b) och (c) för att samla benmärg från den andra lårbenet.
- Använd en 10cc spruta fylld med kallt 1X PBS och en 25 gauge nål för att lösgöra benmärgen i ett 50 ml koniskt rör. Benet ska visas helt vit när benmärgen tas bort.
- Passera PBS / märgen blandningen genom en 22 nål för att bryta upp någon benmärg aggregat.
- Snurra på blandningen vid 425 xgi 10 minuter och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 8 ml BMC medium. Tillsätt 1 ml cellsuspension och 9 ml BMC medellång till 8 bakteriologiska petriskålar.
- Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2.
- På dag 5, tillsätt 10 ml BMC medellång till varje platta. På dagen 7 kommer cellerna vara fullt utvecklat. BMCs kan passerats i 1-2 veckor efter mognad.
- För att dela BMCs, ta bort medium och tillsätt 5 ml kall 1X PBS till varje petriskål. Inkubera vid 4 ° C i 30 minuter, tills cellerna börjar lyfta. Skölj BMCs av plattan med en steril överföringspipett.
- Pool på BMCs i en 50 ml koniska rör och pellets vid 425 xgi 10 minuter.
- Suspendera pelleten i 10 ml BMC medium och räkna med en hemocytometer. Seed 2x105 BMCs per brunn i en 24-brunnar med runda glas täckglas på botten. Låt BMCs hålla sig över natten innan infekterar med T. gondii. Överskott BMCs kan reseeded på petriskålar för senare användning.
4. Infektera celler med T. gondii
- Infektera 25 cm 2 kolv konfluenta HFFs med 2x10 6 T. gondii och växa tills cellerna börjar lyse (ca 2-3 dagar).
- Använd en cell skrapa bort den infekterade cellslager värdcellen från vävnadsodling kolven släpp sedan parasiter från värdceller genom att skicka rubbas cellslager genom en 27-nål.
- Använd en hemocytometer för att bestämma antalet parasiter i mediet.
- Infektera 10 5 parasiter per brunn med täckglas av HFF monolager från protokoll 1 eller BMCs från protokoll 3. Låt parasiter invaderar i 3 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2.
5. Initiera T. gondii bradyzoite utveckling genom miljöpåfrestningar
- Bradyzoite utveckling i HFFs med medium pH ökar och CO 2 svält
- Förbered utveckling medium. Utveckling mediet innehåller RPMJag 1640 utan bikarbonat, 1% FBS, 1% penicillin-streptomycin, och 42 mm HEPES. pH till 8,0 och filtrera sterilisera.
- Ta bort DMEM från infekterade HFFs, skölj med 1X PBS och tillsätt 1 ml av utveckling medium.
- Inkubera i 3 dagar vid 37 ° C med omgivande luft.
- Aktivering av BMCs
- Förbered medel för att aktivera BMCs. Aktivering medium är BMC mediet kompletteras med 100U/ml IFN-γ och 100 ng / ml LPS. Sonikera LPS i ett vattenbad i 2 minuter före användning för att störa aggregat.
- Ta bort BMC medium från brunnar och ersätta med 1 ml aktivering medium.
- Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 i 3 dagar.
6. Immunofluorescens detektion
- Skölj infekterade brunnarna tre gånger med 1X PBS.
- Fäst cellslager med 200ul på 3% formaldehyd i 20 minuter.
- Ta bort fixativ och spola brunnar med 1X PBS.
- Tillsätt 200μl på 0,1 M glycin i brunnarna och låt sitta i 5 minuter.
- Ta bort glycin och spola brunnar med 1X PBS.
- Tillsätt 250 l på 3% BSA/0.2% TritonX-100 i 1X PBS till permeabilize och blockera cellslager i 30 minuter.
- Ta bort blockerande lösningen och skölj brunnar med 1X PBS.
- Tillsätt 50 l av en 1:250 utspädning av Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin i 3% BSA/0.2% Triton X-100 i 1X PBS.
- Täckplåten och lägg på plattformen shaker i rumstemperatur i 1 timme
- Tvätta täckglasen 3 gånger med 0,2% Triton X-100 i 1X PBS i 5 minuter på en plattform shaker.
- Mount täckglas med VectaShield monteringsmedium innehåller 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Målat T. gondii kan visualiseras med hjälp av en fluorescerande mikroskop med ett filter lämpligt för Rhodamine vid en förstoring på 100x.
7. Representativa resultat
Figur 1 visar färgning representant DBA för T. gondii i aktiverade BMMs och HFFs under pH stress. Båda visar DBA färgning runt parasit som innehåller vakuoler, tyder på förekomst av komponenter cysta väggen. Den aktiverade BMM Bilden visar DBA färgning som är förenlig med den yta vacuole. Tvärsnittet av T. gondii i pH betonade HFFs visar cysta väggen med några interna strukturer fläckig.
Figur 1. DBA färgning av stressade T. gondii. Intracellulär parasiter under stress villkor, aktiverade BMMs eller pH stressad HFFs, färgades med Rhodamine konjugerad DBA (röd). Differential interferenskontrast (DIC) visar konturerna av cysta och den svarta Skalningsfält motsvarar 2 mikroM.
Djurförsök
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive University of Wisconsin Djurvård och användning kommittén.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots att mekanismen för bradyzoite utvecklingen inte är helt klarlagda, molekylärgenetiska analyser av T. gondii skede konvertering i vävnadskultur har lett till upptäckten av gener som är inblandade i bradyzoite cystbildning 2,3,4. Analyserna ledde också till observationen att vissa bradyzoite markörer uttrycks i andra långvarig stress villkor, inklusive tillväxt i aktiverade makrofager 5,6. Ovanstående metoder beskriver hur man odlar T. gondii och framkalla utveckling en DBA positiv cysta väggkonstruktion i både BMCs och HFFs. Resultaten understryker att cysta utvecklingen vägen kan orsakas av olika stressfaktorer stimuli.
Eftersom T. gondii kan växa i nästan alla kärnförande celler från varmblodiga värdar, kan många celltyper användas för odling av T. gondii in vitro. HFFs användes i detta protokoll för att de är en kontakt hämmade cellinje. Sedan cellodling bradyzoite utveckling tar tre dagar, är det lättare att använda cellinjer som inte kommer att växa över. HFFs är primära celler som inte kan odlas på obestämd tid. Ju längre HFFs är passerats in vävnadskultur, desto mindre toleranta blir de för höga pH-medium och därmed mindre oanvändbar de blir för bradyzoite växling. För bästa resultat bör värdceller vara låg passage och får möjlighet att vila minst en vecka efter att ha blivit konfluenta. Det finns alternativa metoder för att förmå utveckling bradyzoites som har olika effekter på värdcellen 7.
T. gondii trivs i många immuna celltyper. För vissa tillämpningar, BMCs är att föredra framför makrofagcellinjer cellinjer eftersom de undviker artefakter som kan ha införts av immortalisering 8. BMCs är även bra för in vitro-försök eftersom de har en platt morfologi jämfört med RAW264.7 celler, vilket gör dem mer mottagliga för mikroskopi. Den grundläggande BMC kulturen här beskrivna metoden kan anpassas för andra ändamål, inklusive framställning av BMCs från andra musstammar 9,10. Graden av aktivering ses med IFNγ och LPS kan variera beroende på säljaren och till och med partiet. Det är därför nödvändigt att titrera mängder av LPS och IFNγ används i aktivering medium för optimal och jämn prestanda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av University of Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduate Fellowship (CMT), NIH utmärkelse AI072817 (AMP) och American Heart Association Award 0840059N (LJK).Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
| L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W.
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
