Biology

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

Published: September 20, 2010 doi: 10.3791/2093

Junko Ariga*¹, Steven L. Walker*¹, Jeff S. Mumm¹

¹Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia

* These authors contributed equally

Summary

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של עניין

Abstract

הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות של דג הזברה זחלים חיים יכול להיות מנוצל כדי להמחיש כיצד תהליכים ביולוגיים להתפתח (לסקירה ראה ^1). דג מהונדס מתחם המבטאים כתבים ניאון שונה בסוגי תאים שכנים לספק אמצעי הבאים אינטראקציות הסלולר ² ו / או רקמות ברמה התגובות מניפולציות ניסיוני לאורך זמן. בסרטון הזה אנחנו מדגימים שיטות שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה סוגים שונים בתא שכותרתו transgenically סדרתי על קורסים הזמן יכולה להקיף מ דקות עד מספר ימים דגים בודדים. הטכניקות המתוארות החלות על כל המבקשים ללמוד לקשר בין "התנהגות" של סוגי תאים שכנים לאורך זמן, כולל: "לתפוס ולשחרר '1) סדרתי שיטות הדמיה מספר גדול של דגים על פני ימים רצופים, 2) גישות פשוטה עבור הפרדת fluorophores עם עירור / פליטה פרופילים חופפים (למשל, ה-GFP ו YFP), 3) שימוש קווים מוטנטים hypopigmented להרחיב את חלון הזמן הפנוי הדמיה ברזולוציה גבוהה לתוך הזחל בשלבים המאוחרים של התפתחות, 4) שימוש קרום ממוקד כתבים פלורסנט לחשוף פרט מורפולוגיים קנס של תאים בודדים, כמו גם פרטים הסלולר באוכלוסיות גדולות של תאים, ו 5) שיטה שתואר לעיל עבור אבלציה כימית-Induced של סוגי תאים ממוקד transgenically, כלומר nitroreductase (NTR) המרה בתיווך של מצעים prodrug, כמו metronidazole (MTZ), כדי נגזרים ציטוטוקסיות ^3,5.

כדוגמה הגישות הללו, נוכל לדמיין את אבלציה והתחדשות של תת סוג של הרשתית דו קוטבית נוירון בתוך דגים בודדים על פני כמה ימים. במקביל נוכל לעקוב אחר מספר סוגי תאים ברשתית, כולל הלא ממוקד תאים שכנים דו קוטבית פוטנציאל ניוון-גירוי בתאי גזע הרשתית (כלומר, גליה Mϋller). אסטרטגיה זו מוחל במעבדה שלנו לאפיין תאים ורקמות ברמה (למשל, תא גזע נישה) תגובות לאובדן התחדשות סלקטיבית של סוגי תאים עצביים ממוקד.

Protocol

1. טראנסגנטי ו Mutant קווים

להקים / לרכוש קווי דג הזברה מהונדס, כי יש סוגי תאים עניין שכותרתו דיפרנציאלי עם גרסאות כתב ניאון. באופן אופטימלי, פרופיל עירור / פליטה של הכתבים שנבחרו צריך חפיפה מינימלית (למשל, ECFP ו EYFP), אולם זה אינו נדרש לחלוטין. לענייננו, השימוש קרום קשור לכתבים פלורסנט מאוד מקל הדמיה של פרטים הסלולר בסדר, כגון תהליכי מדלקת עצבים, כדי לפתור מספרי תאים בודדים ו / או מורפולוגיות התמזגו בקבוצות גדולות כדי "לסמן" אזורים של תוכן קרום גבוהה, כגון הסינפטי neuropils.
עבור הדמיה בשלבים הזחל מאוחר, כדאי להפיק / לחצות קווים מהונדס לתוך רקע מוטנטים אשר להפחית פיגמנטציה [למשל, רוי אורביסון (רועי) או רוי אורביסון, לבקן (רועי: Alb); ^4]. מניסיוננו, ירידה של iridiphores (למשל, רוי) הוא הנושא הקריטי ביותר, melanogenesis ניתן לטפל באמצעות כימית 1-2-פניל thiourea (PTU) או עם מוטנטים "לבקן" שבו חוסר melanophores. שים לב, עם זאת, רן et al. ^4, הראו חסכים ויזואליים שינויים מורפולוגיים צנוע הרשתיות של דגי חסר melanaphores, וכי אור חזק יכול לגרום למוות photoreceptor ב מוטנטים "לבקן". לכן, נושאים אלה צריכים להילקח בחשבון בעת תכנון ניסויים הדמיה ו / או נתונים לפירוש.
להדגמה זו, קווי דג מהונדס והוא מוטציה השתמשו היו:
1. Tg (ניקס: Gal4-VP16) ^{q16a / +;} Tg (כטב"מ: gap43-YFP) ^{q16b / +;} Tg (כטב"מ-E1b: NfsB-mCherry) ^{c264 / +;} Tg (pax6-DF4: gap43-CFP) ^{q01 / +;} רועי ^a9/a9
3. הערה: דגים "1", subpopulation של האמרגן-ניקס מוגדר תאים ברשתית דו קוטבית להביע קרום מתויג YFP ו / או כתב NTR-mCherry היתוך (ביותר לבטא את שניהם), וכמעט כל התאים ברשתית להביע קרום מתויג CFP . דגים "2" הם כאמור לעיל, פרט לתאי גליה מולר להביע GFP cytosolic ו CFP העולמי ביטוי רשתית מוגר. הביטוי של היתוך NTR-mCherry הופך ניקס מוגדרים תאים דו קוטבית רגישים אבלציה prodrug-Induced ^3,5.

2. בחירה הכנת עוברים / זחלים עבור הדמיה חיה

מטה מהונדס / קווים מוטנטים של עניין, לאסוף ביצים דגירה / לשמור על 28.5 ° C בתמיסה 0.3X של Danieau (או "בינוני העובר" הבחירה).
אם לא רקע "לבקן", PTU יש להוסיף לעכב פעילות טירוסינאז לפני כל ראיה של פיגמנטציה ברקמות של עניין (לדוגמה, ~ 16 hpf לעין, 200 מיקרומטר הסופי). שים לב כי טיפול PTU בריכוזים מעל 75 מיקרומטר עלול לגרום לרעילות ו / או השפעות טרטוגניות. עם זאת, כי העין הוא פיגמנט מאוד, טיפולים להלן 200 מיקרומטר לא מתאימים confocal הדמיה ברזולוציה גבוהה, בתנאים אלו חשוב לבחור דגים בריאים הדמיה מחפש. עבור רקמות הדמיה אחרות, 75 מיקרומטר PTU עשוי להיות עדיף. כמו כן, כפי שצוין לעיל, השימוש בקווים "לבקן" מוטציה obviates את הצורך לטפל בעוברים עם PTU וגם היא אסטרטגיה המועדפת עבור הדמיה בשלבים הזחל המאוחרות.
ברגע לכתבים פלורסנט דגים מאליו, למיין לפי transgene הביטוי בריאות כללית באמצעות סטריאו מיקרוסקופ פלואורסצנטי זום או דומה.
לפני היום הראשון של הדמיה, לפזר נמוכה להמיס agarose (אה"ע) במדיום העובר לריכוז סופי של 0.5%, חום ומערבבים להיכנס לחנות פתרון, בשעה 40 ° C.
ביום הראשון של הדמיה, להכין פתרון הרכבה: הוסף tricaine (הרדמה, 756 מיקרומטר סופי) ו PTU (במידת הצורך) על אה"ע 0.5% במדיום העובר, מערבבים בעדינות, לחזור 40 ° C.
הרדימי דגים ידי העברת לתוך מדיום העובר המכיל PTU ו / או tricaine, לאפשר זמן דגים להפוך שאינם מגיבים למגע (~ 3 דקות).
העברת דגים הפרט בפתרון הרכבה, נזהרת שלא לדלל את agarose כך ניתן לעשות שימוש חוזר. אנו משתמשים micropipette עם קצה להעברת גזוז, זה גם עוזר לשמור על נפח מבוקר (~ 30 μL). לאחר רכישת, להפוך פיפטה ולתת דגים ליישב לתחתית כך נוגע קצה לפתרון הרכבה מאפשר העברת הכובד ללא צורך להפיג כל נוזל.
לאחר ההעברה, לגרש מן ההרדמה micropipette ולהשתמש בו כדי להעביר את הדגים אגל 30 ~ μL של פתרון הרכבה כדי בצלחת פטרי.
הערה: שיטה זו הרכבה הוא רק רלוונטי במיקרוסקופ שבו זקוף ארוך לעבוד מים מרחק מטרות טבילה ישמש. למעניthods רלוונטי מיקרוסקופים הפוכה, שבה coverslips נדרשים, ראה אנדרסן et al, 2010;. אובריאן et al, 2009;. Graeden ו אלימה, 2009.
חזור פתרון גובר לחסום 40 מעלות צלזיוס החימום.
באמצעות מברשת ריסים או דומה בעדינות לסובב דגים לתוך הכיוון הרצוי ואת המיקום את האזור של עניין במרכז אגל agarose.
חזור על שלבים 6-10 כדי לעלות את המספר הרצוי של עוברים לכל מאכל. במשך זמן לשגות ניסויים סדרתי (ראו להלן) אנחנו בדרך כלל הר שישה דגים בכל פעם, מנסה להגביל את הפגישות הדמיה עד 1 שעה לכל קבוצה.
בעוד דגים אחרים הרכבה בדוק שוב כדי לוודא נושאים קודמים לשמור על הכיוון הרצוי עד agarose מבצרת (~ 3 דקות).
לאחר agarose יש הקרושה, תחבורה דגים לשלב מיקרוסקופ confocal בעדינות להוסיף בינוני העובר המכיל PTU ו / או tricaine כדי בצלחת עד שכל הדגים שקוע לחלוטין.

3. "ססגוניות" in vivo Confocal הדמיה

הערה: יש לנו ניסו להכליל את פרוטוקול למטה כזה זה מספק מידע רלוונטי עבור תצורות מיקרוסקופ אחרים. התייחסויות ספציפיות אולימפוס ויישומים ImageJ תוכנה במרכאות. מערכת ההדמיה שלנו היא מיקרוסקופ FV1000 אולימפוס confocal זקוף מצויד 405, 440, 488, 515, 559, ו 635 ננומטר לייזרים, שתי משתנה לסנן מחסום איתור ערוצי (המאפשר הגדרות פליטת גל להיות מותאמים במרווחים של 1 ננומטר), אחד מחסום תקן מסנן ערוץ (עבור אדום הדמיה אדום רחוק), ואחד מועבר ערוץ אור.

פתח את תוכנת הדמיה ("FV10-ASW") ולהשתמש במקורות האור המועבר או פלורסנט כדי לאתר את האזור של עניין. עבור הדמיה אופטימלית של הסלולר ו / או המולקולרית להשתמש בפרטים ארוכת עובד מטרות ממרחק עם NA גבוה (למשל, 60x, 1.2NA).
אם איסוף תמונות האור המועבר, למקד את הסרעפת שדה תאורה קולר.

בחר fluorphores המתאים מתוך "רשימת דיי" או לטעון פרמטרים לרכישת מקובץ תמונה שנשמרו בעבר. בצע התאמות טווחי פליטה ("הגדרת רפאים") יש צורך בהפרדה נקייה של אותות כתב ו / או אות מקסימאלית על יחס רעש. הגדרות אלו יהיה צורך להגדיר באופן אמפירי עבור כל ניסוי כדי למזער crosstalk אלא למקסם את האות; הגדרות עבור הדוגמאות הניתן כאן מוצגות להלן:

Flourphores	לייזרים (ננומטר)	הגדר הגדרות / פליטה סינון (ננומטר)
1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
2) EGFP , EYFP, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

* הדמיה של mCherry אפשר לשפר באמצעות לייזר באורך גל גבוה יותר (למשל, 568 או 594 ננומטר)
** מצב המאפשר הדמיה רציפים dichroic מראה מחסום שינויים מסנן ("ערוצים וירטואלי") נדרש בשל פליטה / עירור חפיפה בין ה-GFP ו YFP. GFP ו mCherry ניתן להקצות ערוץ אחד, YFP לערוץ נפרד. הערה: crosstalk בין GFP ותמונות YFP יהיה ברור לפני תמונה חיסור (חלק 6).

ודא כי המטרה בשימוש נבחרה התפריט הנפתח, כדי להבטיח כל תוכנה presets מוגדר מותאמים כהלכה.
כדי להתמקד לייזרים הכוח להגדיר רמות, בחר להסתכל למעלה בטבלה (LUT) מגלה כי הרוויה פיקסל ("Hi-lo") עבור כל ערוץ. גלאי רגישות הגדר ("HV", מתח PMT) לערך בקנה אחד עם איכות התמונה הרצויה (המוגדר באופן אמפירי), ובהדרגה להעלות את התפוקה עד לייזר בעוצמה תמונה מקובל למנוע הרוויה פיקסל.
בדוק crosstalk בין ערוצים; להבטיח כי כל שורה לייזר מייצר אות לגילוי רק בערוץ המתאימים באופן ידני על ידי הפיכת לייזרים לסירוגין תוך מעקב אחר כל הערוצים הדמיה. כדי למנוע crosstalk להפחית כוח לייזר. אם crosstalk לא ברור, כל הערוצים ניתן לרכוש בו זמנית לספק חיסכון משמעותי בזמן.
במקרה של crosstalk בלתי נמנעת, יש להשתמש במצב "סדרתית" הדמיה בוררים בין לייזרים / הערוצים בנפרד. במקרים קיצוניים (למשל, הדמיה ו-GFP YFP) דורשים שימוש מצבי רציפים כי גם לעבור מראות dichroic ו / או מסננים מחסום ("ערוצים וירטואלי"). הערה: אפשרות זו מציגה עיכובים הזמני משמעותי בתהליך רכישת התמונה לא יכול להיות appropriate ללכידת תהליכים דינמיים מאוד.
"זום" פונקציות "סיבוב" ניתן להשתמש בהם כדי לקדם את מסגרת שטח של עניין. זום יכול לשמש גם כדי לשפר את רזולוציית התמונה, עד גבולות פורמט אובייקטיבי לסרוק את המשמשים (למשל, 512 x 512; לקבלת מידע על נושאים אלה לראות, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf).
עבור vivo בתחום ההדמיה בכלל, חשיבות מיוחדת עבור דימות זמן לשגות, טכניקות אשר למזער את בעיות phototoxicity (כלומר, הצטברות של רדיקלים חופשיים) צריך להדגיש, מהירויות סריקה מהירה (למשל, 2 μs / פיקסל) ו פלט לייזר נמוך רמות (למשל, 1%) יש להשתמש במידת האפשר, וכן לסרוק את הרזולוציה הנמוכה ביותר בפורמט מתאים לכידת מידע מובהק.
כדי לשפר את רזולוציית התמונה, סריקה בממוצע ("קלמן") יכול לשמש במהלך הרכישה. מהירויות סריקה איטית יותר גם לשפר את הרזולוציה אבל לייזר להגדיל להתעכב זמן, אשר תוביל להחרפת phototoxicity ונושאים הלבנה. שים לב הן של גישות אלה אינם אידיאליים עבור לשגות בזמן בשל פוטנציאל היכולת לתפוס שינויים מהירים פני z-series, תופעה שאנו מכנים "לטשטש זמן". שים לב, לעומת ממוצע של הקו על ידי מסגרת יכולה לעזור לחסל "לטשטש זמן" בעיות בתוך מטוס בודד, אך לא מעבר Z-עומק.
אם עוצמות אות נמוכים רזולוציית התמונה המקסימלית אינו נדרש (למשל, פשוט לספור מספרים התא), להגדיל את הצמצם confocal (קוטר חריר) ניתן להשתמש כדי להגביר את האות. זה משמש כדי לשמור על עוצמות לייזר נמוך, הפחתת phototoxicity ואת הלבנה, אולם כיוון את הצמצם ערך גדול מ 1 יחידה אוורירי מוביל להפסדים מהירים איכות התמונה.
הגדרת Z-עומק ממדים באמצעות מצב הסריקה המהירה ("פוקוס x4"). בגלל עוצמת האות בדרך כלל יורדת עם Z-עומק עדיף להתחיל Z-מחסנית רכישות בעומק הנמוך ביותר ולסיים את שטחית ביותר, זה מאפשר אותות קשה יותר להירכש לפני משמעותי הלבנה מתרחשת.
בדוק לגילוי האות מספקת לאורך עומק בתמונה. אם תרצה, Z-הממד תיקון בהירות פונקציה ("Z מוארת") ניתן להשתמש כדי להתאים את הפרמטרים רכישת תמונה בעומקים שצוין.
הגדר את גודל Z-מימד צעד בהתאם לצרכים ניסיוניים. למשל, בדוגמה הראשונה שלנו (איור 1) שאנחנו פשוט לוקחים "מפקד התא" ב הרשתיות בודדים במשך ימים רצופים, ולכן אנו קובעים את Z-עומק 15 מיקרון ולקח 06:55 תמונות לכל הרשתית. אסטרטגיה זו אפשרה לנו לטעום כל הרשתית ללא חפיפה בין תמונות הסלולר. בדוגמה השנייה שלנו (איור 2), ביצענו מהיר 4D זמן לשגות סרטים שבהם GFP ו mCherry אותות צריכה להיות בקורלציה מרחבית, ולכן אנו קובעים את גודל הצעד החלטת שלוש פעמים לרוחב התיאורטי פשרה שאיפשר Z-מחסנית תמונות להילקח בכל 5-10 דקות, אך שימש עדיין לפתור פרט הסלולר הפרט.
לרכוש תמונות ("XYLZt") ולשמור. עבור אל הדג הבא אם ביצוע הניסוי סדרתי זמן לשגות (ראה # 4 להלן). עבור מהיר זמן לשגות הדמיה לראות # 5 להלן.

4. טורי "לתפוס ולשחרר" הדמיה: שיטה למעקב שינויים נייד ב דגים בודדים במהלך ימים רצופים

"לתפוס ולשחרר" פרוטוקול משמש כדי לצמצם את כמות הדגים זמן הם משותק להגדיל את מספר הדגים צילמו לכל ניסוי. התועלת של טכניקה זו מוגבל תהליכים ביולוגיים אשר נפרשים על פני ימים (למשל, השמפניה et al. 2006 ^2). אחד היתרונות של גישה זו הוא שהיא מאפשרת לכל השינויים שנצפו להיות נשלט באופן פנימי, כלומר, השוואה בין מצבים שונים של יחידים ולא על פני אוכלוסיות. למשל, מעקב אחר שינויים במספר התאים שכותרתו נוכח ברקמות נתון יכול להתבצע באופן מדויק, גם אם מספר התאים שכותרתו בתחילה משתנה מאוד בין דגים בודדים. שיטות לשימוש בפרוטוקול זה בהקשר של assay prodrug המושרה תא אבלציה ^3,5 ניתנים כאן.
כדי להמחיש את אבלציה והתחדשות של תאים מסוגים ממוקד דגים בודדים לאורך זמן, תמונות confocal נרכשים לפני הממשל prodrug (לפני הטיפול), מיד לאחר הסרת prodrug (לאחר טיפול) ובתקופת התאוששות (שחזור תמונות).
טרום טיפול הדמיה: דגים הם רכוב צילמו לעיל. לאחר הדגים כבר צילמו הם שוחררו לתוך מדיום העובר (prodrug +) ו מודגרות ב 28.5 ° C עד לפגישה לאחר הטיפול הדמיה. עבודה בצוותים של שניים, אחד גובר ושחרור דגים, הדמיה אחרים היא דרך טובה להגדיל את מספר הדגים כי ניתן הדמיה ליום.
לאחר הדמיה כל דג בצלחת אחת להחליף את מדיום העובר המכיל tricaine בינוני עם העובר לבד (+ / - PTU).
כדי לשחרר דגים, להשתמש במלקחיים תכשיטנים לחתוך agarose משני צידי הזחלים ואז בעדינות להקניט agarose משם עד הדג צף בחופשיות בינוני העובר.
Prodrug-Induced אבלציה: הזחלים העברה אל הפרט גם צלחת multiwell העובר המכיל בינוני (+ / - PTU) + prodrug (למשל 10mm metronidazole, MTZ). כדי להבטיח מדויק ריכוזי prodrug הסופי שאנחנו בדרך כלל aliquot נפח מוגדר בינוני של העובר (+ / - PTU) המכיל ריכוז של 2X prodrug (למשל, 20 mM) לתוך הבאר כל אחד. דגים מתווספים אז בארות בנפח שווה של העובר בינוני (+ / - PTU) כדי להביא את ריכוז prodrug הסופי 1X.
לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס עד אבלציה תא ממוקד ניתן לאמת.
הערה: טיפול prodrug משטרי הנדרש כדי להשיג אבלציה מוצלחת להשתנות בהתאם לסוג תא ממוקד; ריכוז prodrug ואת משך הטיפול יהיה צורך נקבע באופן אמפירי, להיות מודע לכך בריכוזים גבוהים לגרום לרעילות הכללית, למשל> 10 mM MTZ. בנוסף, perdurance של אותות כתב מקוטעת יכול לסבך את ההערכות של הצלחה אבלציה, ובמקרים מסוימים מיקרוסקופיה confocal נדרשת כראוי לדמיין אובדן התא.
לאחר טיפול הדמיה: דגים הם רכובים כזה רקמות זהה מכוונת בצורה אופטימלית הדמיה לעיל. לאחר כל דג על צלחת נתון כבר צילמו הם שוחררו לתוך מדיום העובר (+ / - PTU) לתוך בארות בודדים (כמו לעיל) מודגרות ב 28.5 ° C כדי לאפשר התחדשות של סוג תא ablated.
בהתאם לגיל של הדג ואת הזמן הנדרש להתאוששות זה עשוי להיות נחוץ כדי להאכיל את הדגים בשלב זה של assay. אנו משתמשים במזון חי כגון בסנדליות או rotifers להבטיח את הישרדותו אופטימלית. כמו כן, מומלץ לספק מדיה טרי מדי יום, במיוחד אם הדגים נשמרים בכמויות נמוכות (למשל, 96 צלחות טוב).
שחזור הדמיה: כדי לתעד את קינטיקה של התחדשות התאים, דגים ניתן הדמיה על בסיס יומי במהלך תקופת ההחלמה. לאחר קינטיקה הוקמו assay ניתן לפשט באמצעות רכישת תמונות התאוששות רק בנקודות זמן עניין (התאוששות למשל, מלא). איור 1 מספק דוגמה לגישה זו ממחקרים שלנו של התחדשות התאים ברשתית.
בסיומו של הניסוי הדגים צריך להיות מורדמים ע"י טבילה בתמיסת 20X (15.3 מיקרומטר) tricaine על הקרח.

5. הדמיה מהירה זמן לשגות.

הדמיה מהירה זמן לשגות (כלומר, "סרטים") של fluorphores מרובים, טכניקות למזער את בעיות phototoxicity חיוניים (ראה לעיל). כאמור לעיל, טכניקה זו היא המתאימה ביותר fluorphores המאפשר בו זמנית, ולא רציפים, הדמיה
שמור על הדגים 28.5 ° C באמצעות הבמה מחוממת, איטו אלמנט זכוכית חימום, או דומה.
השתמש בשיטות להפחית אידוי כדי לעזור לייצב את הטמפרטורה osmolarity (למשל, O-טבעת coverslips אטום עבור מיקרוסקופים הפוכה).
אם באמצעות רכישה אוטומטית על פי המורחבת להיות בטוח כדי לקבוע את גודל מחסנית כדי לאפשר צמיחה ו / או להיסחף בממד-z.
הגדרת מרווחי זמן של מספר סריקות ("TimeScan" או "TimeController"). שיעורי רכישה יהיה צורך הוקמה אמפירית על פי הדינמיקה של תהליך ביולוגי הדמיה ו / או מותאם על פי מאפייני רגישות phototoxic האוכלוסייה תא של עניין.
לרכוש תמונות ("XYLZt" כפתור) ולשמור.
כדי לבנות 'סרטים', תחומי עניין צריך להיות מוגדר בציר x, y, z ו - ממדים. התהליך השלם הוא מעבר להיקף של סקירה זו פרוטוקול אבל תוכנות מספר אשר זמינים גם להקל, זום סיבוב, פונקציות פנורמי במהלך 4D תמונת הרכבה (Volocity, עמירה, וכו ').

6. ההפרדה Spectral עיבוד תמונה באמצעות Imagej Freeware

באופן אופטימלי, בעת ביצוע רב כתב הדמיה הניסוי עדיף להשתמש fluorphores כי מופרדים היטב spectrally. עם זאת, זה לא תמיד מעשי ו / או אפשרי. כאן אנו מספקים שיטה פשוטה להפרדת fluorphores כי יש חפיפה פרופילים עירור ופליטה, ב-GFP מקרה זה YFP. בדוגמה בתנאי, השתמשנו זמן לשגות שיטות הדמיה שתוארו לעיל כדי לעקוב אחר התנהגות של ה-GFP, שכותרתו "בתאי גזע" רשתית, גליה מולר, במהלך אבלציה התחדשות ממוקד של תאים ברשתית דו קוטבית שכותרתו עם YFP ו-NTR mCherry (איור 2).
איסוף תמונות באמצעות מצבי הדמיה רציפים ומסננים מחסום משתנה המאפשרים fluorophores חופפים להיות נרכש באופן עצמאי מופרדים חלקית, בהתאמה (ראה לעיל למשל הגדרות ה-GFP / YFP). כדי להסיר crosstalk נשתמש תמונה פשוטה חיסור אסטרטגיה אשר פושט ערוצי אות אחרת.
תמונה תהליך חיסור: להתקיןאני את הגירסה האחרונה של ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), לוקוסים ביו פורמטים כלי (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) , וליישר ערימות Plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
השתמש לוקוסים ביו פורמטים ייבוא התוספת כדי לפתוח קבצי תמונה, פשוט גוררים את הקובץ של עניין על החלון ImageJ יתחיל לייבא את הכלי. פיצול ערוצי בערימות הפרט באמצעות "ערוצי פיצול" תיבת הסימון בחלון לייבא או "ערוצים פיצול" תחת הלשונית "כלים ערוץ" (Shift + Ctrl + z) לאחר טעינה.
הפעל את יישור 3 TP תוסף (plugins> יישר ערימות> יישור 3 TP). ערימות צריך להיות מתואם כדי להבטיח חיסור מתאים. בחר את מחסנית הפניה בתיבה הנפתחת הראשונה מחסנית אי - בציר השני. בדוק את "xy להשתמש ממוצא יחסית" ו "להשתמש z יחסית המקור" תיבות ולחץ על "אישור".
כדי להתחיל את תהליך היישור, לחץ על "רישום כרך" כפתור. חלון חדש יופיע המכיל את הפרמטרים יישור. סעיף זה עבר אופטימיזציה על ידי המפיץ של plugin, שינויים לא נחוצים, פשוט לחצו על "אישור".
בסיום, "מסודרים ערימות" חלון יופיע. בחר "פלט" מן החלון יישר את וחלון פלט אמור להופיע. חלון זה הוא מותאם גם לצרכים שום שינוי. לחץ על "אישור". ערימה חדש אמור להופיע במרחב לעבוד עם "מסודרים" המצורף בסוף כותרת הקובץ.
Crosstalk יוסרו באמצעות "מחשבון תמונה" (תהליך> מחשבון תמונה). בחר את הערימה להיות מופחתים בתיבה הנפתחת Image1 ואת מחסנית בשימוש חיסור בתיבה הנפתחת Image2. בחר "הפחת" בתיבה מבצע הנפתחת ולחץ על "אישור". ImageJ יבקש לתהליך מחסנית, בחר "כן". ערימה חדש אמור להופיע אשר הסיר את crosstalk בין ערוצים חופפים.
כדי לשחזר את מבנה אותה תמונה לפני ערימות יישור וחיסור צריך להיות ממוזג. בחר "ערוצי מיזוג" בחלון ערוץ כלים. הכלי יאפשר לך למזג עד ארבע ערימות לתוך hyperstack.
הערה: כדי למזג יותר מ 4 ערימות, ערימות לשרשר לפי הסדר הרצוי באמצעות הכלי לשרשר (תמונות> ערימות> כלים> לשרשר). המר את ערימת בשרשור כדי hyperstack (מחסנית תמונות>> hyperstack כדי hyperstack). שרשור של ערימות משנה את עומק, זמן, ערוץ (zct) צו, זה צריך להיות לאפס בתוך התיבה הנפתחת שמופיעה; להגדיר "כדי" xyztc, להגדיר "תעלות", "פרוסות" ו "מסגרות" על פי מספר ערימות, עומק של מחסנית, ואת מספר נקודות זמן, בהתאמה ..
לבסוף, כל הערוצים צריכים להיות צבעונית, המותאמת הבהירות והניגודיות, והציל כקבצי TIFF. מכאן, המרה ל-RGB, מונטאז', Z-הקרנת, או סדרת זמן הוא תהליך זהה את הקבצים המקוריים.

7. נציג תוצאות

באיור 1. סדרת זמן לשגות של תמונות confocal הוכחת הפסד התחדשות ממוקד של NTR-mCherry לבטא בתאי הרשתית דו קוטבית (כדוריות דם אדומות). A & A ") לפני הטיפול יש ביטוי פסיפס של קרום מתויג כתב YFP בתאים" שליטה "דו קוטבית, המוצג צהוב nitroreductase-Cherry חלבון היתוך bipolars" ממוקד "באדום. B & B ') בעקבות הטיפול עם metronidazole, האדום nitroreductase-להביע תאים דו קוטבית, הולכים לאיבוד, בעוד הצהוב "שליטה" דו קוטבית תאים, הם חסכו. זה מדגים את האופי מאוד ספציפיות של מתודולוגיה זו אבלציה. ) C & "ג כאשר metronidazole מוסר, NTR-לבטא (אדום) בתאי לחזור.

איור 2. מספק דוגמה של תהליך החיסור תמונה המאפשרת GFP ו YFP להיפרד בצורה נקייה הרכישה הבאה. A & A ") לפני חיסור, GFP (ירוק) ו YFP (pseudocolored סגול) תמונות מיושרים. B & B ') תהליך החיסור מאפשר YFP שכותרתו תאים דו קוטבית להסיר מהתמונה GFP, המאפשר GFP שכותרתו גליה מולר להיות מזוהה בקלות רבה יותר. C & C ') עמית ביטוי של GFP (ירוק) ו mCherry (אדום) ניכר בתא שמסומן על ידי החץ. בגלל שיתוף ביטוי את הסמן לתא גליה מולר סמן דו קוטבית תא עולה כי אבלציה תא דו קוטבית גורמת גליה מולר להחליף את התאים לאיבוד. פרשנות זו עולה בקנה אחד עם מחקרים עדכניים של התחדשות הרשתית אשר לסבך גליה מולר כמו "בתאי גזע" פגיעה הנגרמת הן יונקים ודגים.

Discussion

בסרטון הזה, סקירה של טכניקות אנו משתמשים עבור הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופק. אנו מעסיקים זמן לשגות הדמיה לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של עניין in vivo, בעוד אבלציה תא ממוקד משמש ללמוד לתפקד מעגלים עצביים תא ספציפי פרדיגמות התחדשות הנוירונים. הדוגמאות הראו להדגיש כמה יתרונות כי ניתן ללמוד מן הגישות הללו. אולי הכי משמעותי, זמן לשגות הדמיה מספקת הפרדיגמה נשלטת פנימי; פי כל התופעות שנצפו יכול להיות קשור אל מדינות הקודם. זה מאפשר השוואה ישירה ולא להסיק להתבצע על פני נקודות זמן הניסוי, ביצוע שינויים יחסית קל לכמת והפחתת 'רעש' ניסיוני הקשורים וריאציות בתוך אוכלוסיה. היתרון של ססגוניות הדמיה היא היכולת לחזות שינויים אינטראקציה ו / או סוגי תאים סמוכים. למשל, באמצעות קו מהונדס אשר תוויות גליה Müller, אנו נמצאים כעת המאפיינת את התגובה של אלה פגיעה הנגרמת תאים פוטנציאל גזע לאובדן בדידה subpopulations תא הרשתית. יש לנו גם השתמשו בגישה זו כדי להגדיר מנגנוני הרומן של היווצרות מעגלים עצביים ^2. לבסוף, בנוסף מחקרים של התחדשות התאים, התחלנו לאחרונה באמצעות מערכת NTR מבוססי אבלציה כדי לחקור את תפקיד פונקציונלי של תת העצבית ובכך מעגלים עצביים נפרדים באמצעות פרדיגמות התנהגותיים שונים מבחני אלקטרו. היתרון הייחודי של העסקת דג הזברה של מחקרים כאלה היא, כי בשל יכולת ההתחדשות שלהם, גירעונות המושרה הן זמניות. לכן, על ידי correlating עם זמן לשגות מבחני הדמיה נוכל מאפיינות מנגנוני reinnervation להוביל, כמו גם את מידת reinnervation הנדרש להתאוששות, פונקציונלי.

שיטות סיפק ניתן להתאים שאלות רבות ושונות. למשל, ניתוח דומה של אבלציה והתחדשות יכול להיות מיושם על כל תת הסלולר definable transgenically. ביחד, מחקרים כאלה יש פוטנציאל להרחיב את ההבנה שלנו של התחדשות ברמה של סוגי תאים בודדים בתוך נישות תא גזע נפרד.

Disclosures

JSM זכתה פטנט על השימוש במערכת nitroreductase המבוסס על אבלציה של תא דג הזברה (השמפניה JS, ו שרוטר, EH אבלציה אבלציה ממוקדים האזורית נייד של דג הזברה "פטנט אמריקאי 7514595. 7 אפריל 2009). טכניקה זו משמש פלטפורמה הרחב כלים ושירותים חברת הביוטכנולוגיה, Luminomics, Inc, אשר נוסדה JSM ונשאר בעל עניין בה

Acknowledgments

אנו מבקשים להודות לד"ר. למירה סאקסנה ויונתן מתיאס על הערות מועילות על כתב היד. אנו מודים בני הזוג. מייקל פרסונס, פמלה ריימונד, ורחל וונג לאספקת קווי מהונדס. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי IACUC מק"ג אושר פרוטוקול 07-12-003 * B. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 MH083614 ו מצעד הפרוטות פרס בזיל O האשכול Scholar קונר כדי JSM

Materials

1. Reagents:
Danieau's solution:
sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)
Other reagents:
Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)
2. Supplies:
Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)
3. Equipment:
Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).