Biology

बहुरंगा ट्रांसजेनिक Zebrafish की इमेजिंग समय चूक: Visualizing रेटिना स्टेम लक्षित Neuronal सेल एबलेशन द्वारा सक्रिय कक्ष

Published: September 20, 2010 doi: 10.3791/2093

Junko Ariga*¹, Steven L. Walker*¹, Jeff S. Mumm¹

¹Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia

* These authors contributed equally

Summary

इस वीडियो में, बहुरंगा इमेजिंग confocal समय चूक और लक्षित सेल पृथक के लिए तकनीक प्रदान की जाती हैं. समय चूक इमेजिंग के लिए ब्याज की कई प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया है

Abstract

रह zebrafish लार्वा की उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग के लिए जैविक प्रक्रियाओं कैसे उधेड़ना (समीक्षा के लिए ¹ देख) कल्पना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. यौगिक ट्रांसजेनिक मछली जो पड़ोसी सेल प्रकार में अलग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त समय के साथ प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती सेलुलर ² बातचीत और / या ऊतक स्तर प्रतिक्रियाओं निम्न में से एक साधन प्रदान करते हैं. इस वीडियो में, हम तरीके कि इमेजिंग एकाधिक transgenically लेबल सेल प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है serially समय पाठ्यक्रम है कि कई दिनों मिनट से अवधि कर सकते हैं पर व्यक्तिगत मछली में प्रदर्शित करता है. तकनीक वर्णित किसी भी समय पर सहित पड़ोसी की कोशिकाओं के प्रकार के "व्यवहार", सहसंबंधी की मांग अध्ययन करने के लिए लागू होते हैं: 1) धारावाहिक 'पकड़ने और लगातार दिन, 2 पर एक मछली की एक बड़ी संख्या में रिलीज' इमेजिंग के लिए तरीके) अलग करने के लिए सरल दृष्टिकोण अतिव्यापी उत्तेजना / उत्सर्जन (जैसे, GFP, और YFP) प्रोफाइल, 3) hypopigmented उत्परिवर्ती लाइनों का उपयोग करने के लिए समय खिड़की 4, विकास की देर लार्वा चरणों में उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उपलब्ध का विस्तार) फ्लोरोसेंट संवाददाताओं को प्रकट करने के लिए लक्षित झिल्ली के उपयोग के साथ fluorophores व्यक्ति के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं कोशिकाओं की बड़ी आबादी में सेलुलर विवरण, और 5) transgenically लक्षित सेल प्रकार के रासायनिक प्रेरित पृथक के लिए एक पहले से वर्णित विधि के ठीक रूपात्मक विस्तार, यानी, (एनटीआर) prodrug substrates के मध्यस्थता रूपांतरण nitroreductase metronidazole जैसे, (MTZ) साइटोटोक्सिक ^3,5 डेरिवेटिव के लिए.

इन तरीकों के एक उदाहरण के रूप में, हम पृथक और व्यक्तिगत मछली के भीतर कई दिनों में रेटिना द्विध्रुवी न्यूरॉन के एक उप प्रकार के उत्थान की कल्पना जाएगा. इसके साथ ही हम पड़ोसी गैर - लक्षित द्विध्रुवी कोशिकाओं और संभावित अध: पतन उत्तेजित रेटिना स्टेम कोशिकाओं (यानी, Mϋller glia) सहित कई अन्य रेटिना सेल प्रकार, निगरानी करेंगे. इस रणनीति हमारी प्रयोगशाला में लागू किया जा रहा है चयनात्मक और लक्षित neuronal सेल प्रकार के नुकसान के उत्थान के लिए सेल और ऊतक (जैसे, स्टेम सेल आला) स्तर प्रतिक्रियाओं विशेषताएँ.

Protocol

1. ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती लाइन्स

स्थापना / अधिग्रहण ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों है कि ब्याज विभिन्न फ्लोरोसेंट संवाददाता वेरिएंट के साथ लेबल की कोशिका प्रकार है. इष्टतम, चयनित पत्रकारों के प्रोफ़ाइल / उत्तेजना उत्सर्जन न्यूनतम ओवरलैप (उदाहरण के लिए, ECFP और EYFP) होना चाहिए, लेकिन यह बिल्कुल आवश्यक नहीं है. हमारे प्रयोजनों के लिए, झिल्ली का उपयोग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं सीमित बहुत neuritic प्रक्रियाओं के रूप में ठीक सेलुलर विवरण के इमेजिंग सुविधा, अलग - अलग सेल नंबर और / या बड़े comingled समूहों में morphologies को हल करने और उच्च झिल्ली सामग्री के क्षेत्रों जैसे, 'उजागर' synaptic neuropils.
देर से लार्वा चरणों में इमेजिंग के लिए, यह उपयोगी है करने के लिए प्राप्त / उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि जो pigmentation कम में ट्रांसजेनिक लाइन पार [उदाहरण के लिए, रॉय (रॉय) orbison या रॉय orbison, सूरजमुखी मनुष्य (रॉय, alb), ^4]. हमारे अनुभव में, iridiphores की कमी (जैसे, रॉय) सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा है, melanogenesis रासायनिक 2 - Thiourea 1 फिनाइल (PTU) या "सूरजमुखी मनुष्य" म्यूटेंट जो melanophores कमी के साथ का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है. लेकिन ध्यान दें कि रेन अल एट ^4, दृश्य घाटे और मछली के retinas melanaphores कमी में मामूली morphological परिवर्तन का प्रदर्शन किया है, और है कि तीव्र प्रकाश "सूरजमुखी मनुष्य" म्यूटेंट में फोटोरिसेप्टर मृत्यु को उत्पन्न कर सकते हैं. इस प्रकार, इन मुद्दों को ध्यान में रखा जाना जब इमेजिंग प्रयोगों और / या डेटा की व्याख्या डिजाइन की जरूरत है.
इस प्रदर्शन के लिए, ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती मछली इस्तेमाल किया लाइनों गया:
1. टीजी (nyx: Gal4 - VP16) ^{+ / q16a,} टीजी (यूएएस: gap43-YFP) ^{q16b / +,} टीजी (यूएएस E1B: NfsB - mCherry) ^{c264 + /,} टीजी (pax6 - DF4: gap43 - CFP) ^{q01 / +,} रॉय ^a9/a9
3. नोट: मछली "1", nyx - प्रमोटर के एक subpopulation परिभाषित रेटिना कोशिकाओं द्विध्रुवी एक झिल्ली टैग YFP और या एक एनटीआर mCherry संलयन संवाददाता / व्यक्त (सबसे अधिक दोनों व्यक्त), और लगभग सभी रेटिना की कोशिकाओं के एक झिल्ली टैग CFP व्यक्त . मछली "2" के रूप में ऊपर छोड़कर मुलर glia कोशिकाओं साइटोसोलिक GFP एक्सप्रेस और वैश्विक रेटिना CFP अभिव्यक्ति का सफाया किया गया है. एनटीआर - mCherry संलयन की अभिव्यक्ति nyx परिभाषित द्विध्रुवी prodrug प्रेरित ^3,5 पृथक करने के लिए अतिसंवेदनशील कोशिकाओं renders.

2. चयन और भ्रूण / लाइव इमेजिंग के लिए लार्वा तैयारी

मेट ट्रांसजेनिक / ब्याज की उत्परिवर्ती लाइनों, अंडे इकट्ठा करने और सेते / 28.5 पर बनाए रखने ° सी (या पसंद की 'भ्रूण मध्यम') के 0.3X है Danieau समाधान में.
यदि नहीं, तो एक "सूरजमुखी मनुष्य" पृष्ठभूमि में, PTU हित के ऊतक (जैसे, ~ आंख के लिए 16 HPF, 200 सुक्ष्ममापी अंतिम) में pigmentation के कोई सबूत पहले tyrosinase गतिविधि को बाधित करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. ध्यान दें कि PTU साथ 75 सुक्ष्ममापी से अधिक सांद्रता में उपचार विषाक्तता और / या teratogenic प्रभाव का कारण हो सकता है. हालांकि, क्योंकि आंख उच्च pigmented है, 200 सुक्ष्ममापी नीचे उपचार उच्च संकल्प इमेजिंग confocal के लिए पर्याप्त नहीं हैं, इन शर्तों के तहत यह महत्वपूर्ण है इमेजिंग के लिए स्वस्थ तलाश में मछली का चयन करें. इमेजिंग अन्य ऊतकों के लिए, 75 सुक्ष्ममापी PTU बेहतर हो सकता है. इसके अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख है, "सूरजमुखी मनुष्य" उत्परिवर्ती लाइनों का उपयोग PTU साथ भ्रूण इलाज की जरूरत है obviates और देर लार्वा चरणों में एक इमेजिंग के लिए पसंदीदा रणनीति है.
एक बार फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से स्पष्ट, सॉर्ट करने के लिए अभिव्यक्ति और सामान्य स्वास्थ्य के एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो ज़ूम खुर्दबीन या इसी तरह का उपयोग transgene अनुसार मछली रहे हैं.
इमेजिंग के पहले दिन पहले भ्रूण मध्यम में कम पिघल agarose (LMA) 0.5%, गर्मी और मिश्रण का एक अंतिम एकाग्रता के लिए 40 में समाधान की दुकान में मिल भंग डिग्री सेल्सियस
इमेजिंग के पहले दिन पर, बढ़ते समाधान तैयार: भ्रूण माध्यम में 0.5% LMA जोड़ें (एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि, 756 सुक्ष्ममापी अंतिम) tricaine और PTU (यदि आवश्यक), धीरे मिश्रण है, और 40 डिग्री सेल्सियस पर लौटने
भ्रूण PTU और / या tricaine युक्त मध्यम में स्थानांतरित करके मछली anesthetize, मछली के लिए समय गैर स्पर्श उत्तरदायी (~ 3 मिनट) बनने के लिए अनुमति देते हैं.
बढ़ते समाधान में अलग - अलग मछली स्थानांतरण, ख्याल रख रही agarose कमजोर नहीं इतना है कि यह reused किया जा सकता है. हम स्थानांतरित करने के लिए छंटनी की टिप के साथ एक micropipette का उपयोग करें, यह भी एक नियंत्रित मात्रा (~ 30 μL) को बनाए रखने में मदद करता है. विंदुक पलटना बाद प्राप्त करने, और मछली के नीचे बसने ताकि बढ़ते समाधान के लिए टिप को छूने के लिए किसी भी तरल दूर करने की आवश्यकता के बिना गुरुत्वाकर्षण हस्तांतरण की अनुमति देता है.
हस्तांतरण के बाद, micropipette से संवेदनाहारी समाधान निष्कासित और इसका इस्तेमाल करने के लिए एक ~ 30 एक पेट्री डिश के लिए बढ़ते समाधान के μL छोटी बूंद में मछली हस्तांतरण.
नोट: यह बढ़ते विधि केवल ईमानदार माइक्रोस्कोपी जहां लंबी दूरी काम पानी विसर्जन के उद्देश्यों का इस्तेमाल किया जाएगा के लिए प्रासंगिक है. मेरे लियेउल्टे सूक्ष्मदर्शी, जहां coverslips आवश्यक हैं के लिए प्रासंगिक thods, एंडरसन एट अल, 2010, ओ ब्रायन एट अल, 2009; Graeden और sive, 2009.
बढ़ते 40 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक के का हल लौटें.
एक बरौनी ब्रश या इसी तरह का प्रयोग धीरे वांछित अभिविन्यास और स्थिति agarose छोटी बूंद के केंद्र में ब्याज के क्षेत्र में मछली, बारी बारी से.
कदम 6 से 10 पकवान प्रति भ्रूण की वांछित संख्या माउंट दोहराएँ. धारावाहिक समय चूक प्रयोगों के लिए (नीचे देखें) हम आम तौर पर एक समय में छह मछली माउंट और समूह प्रति 1 घंटे इमेजिंग सत्र सीमित करने की कोशिश.
जबकि बढ़ते अन्य मछली वापस जाँच करने के लिए यकीन है कि पिछले विषयों agarose solidifies (~ 3 मिनट) तक वांछित अभिविन्यास बनाए रखने.
बाद agarose जम गया है, confocal खुर्दबीन चरण के लिए मछली परिवहन और धीरे भ्रूण पकवान PTU और / या tricaine युक्त मध्यम जोड़ने जब तक सभी मछली पूरी तरह से जलमग्न हैं.

3. "बहुरंगा" vivo confocal इमेजिंग में

नोट: हम ऐसी है कि यह अन्य खुर्दबीन विन्यास के लिए प्रासंगिक जानकारी प्रदान करता है नीचे प्रोटोकॉल सामान्यीकरण करने की कोशिश की है. ओलिंप और ImageJ सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों के लिए विशिष्ट संदर्भ उद्धरण में हैं. हमारे इमेजिंग प्रणाली एक ओलिंप FV1000 ईमानदार confocal 405 के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप, 440, 488, 515, 559, और 635 एनएम लेज़रों, दो चर बाधा फिल्टर का पता लगाने चैनल (1 एनएम वेतन वृद्धि में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य सेटिंग्स को समायोजित करने की अनुमति), एक मानक बाधा है फिल्टर (लाल और इमेजिंग तक लाल के लिए) चैनल, और एक प्रकाश चैनल संचारित.

इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें ("FV10 - ASW") और ब्याज के क्षेत्र का पता लगाने के लिए या तो प्रेषित या फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोतों का उपयोग करें. सेलुलर और / या उच्च एनए (उदाहरण के लिए, 60x, 1.2NA) के साथ आणविक विस्तार उपयोग लंबी दूरी काम उद्देश्यों इष्टतम इमेजिंग के लिए.
यदि प्रेषित प्रकाश छवियों का संग्रह, Kohler रोशनी के लिए क्षेत्र डायाफ्राम ध्यान केंद्रित.

"डाई" सूची से उपयुक्त fluorphores चुनें या एक पहले से बचाया छवि फ़ाइल से अधिग्रहण मापदंडों लोड. उत्सर्जन पर्वतमाला के लिए समायोजन ("वर्णक्रमीय सेटिंग") संवाददाता संकेतों और / या शोर अनुपात करने के लिए अधिक से अधिक संकेत साफ जुदाई के लिए आवश्यक बनाओ. ये सेटिंग्स empirically प्रत्येक crosstalk कम से कम, लेकिन संकेत को अधिकतम प्रयोग के लिए परिभाषित किया जा आवश्यकता होगी, यहाँ प्रदान उदाहरण के लिए सेटिंग्स नीचे दिखाया गया हैं:

Flourphores	पराबैंगनीकिरण (एनएम)	बैरियर सेटिंग्स / उत्सर्जन फ़िल्टर (एनएम)
1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545 575-675,
2) EGFP , mCherry EYFP	488, 515 559,	500-515, 530-545 575-675,

* इमेजिंग के mCherry एक उच्च लेजर तरंग दैर्ध्य (जैसे, 568 या 594 एनएम) का उपयोग कर सुधार किया जा सकता
** एक अनुक्रमिक इमेजिंग मोड dichroic दर्पण और बाधा फ़िल्टर परिवर्तन ("आभासी चैनल") की अनुमति GFP और YFP बीच / उत्सर्जन उत्तेजना ओवरलैप के कारण आवश्यक है. GFP और mCherry एक चैनल, एक अलग चैनल के लिए YFP को सौंपा जा सकता है. नोट: GFP और YFP छवियों के बीच crosstalk छवि घटाना (भाग 6) से पहले स्पष्ट हो जाएगा.

सुनिश्चित करें कि इस्तेमाल किया जा रहा उद्देश्य ड्रॉप डाउन मेनू में चयनित है किसी भी सॉफ्टवेयर परिभाषित presets ठीक से समायोजित कर रहे हैं सुनिश्चित.
लेज़रों और सेट सत्ता के स्तर को ध्यान केंद्रित करने के लिए, तालिका को एक नज़र (LUT) कि प्रत्येक चैनल के लिए पिक्सेल संतृप्ति ("हाय-Lo") से पता चलता है का चयन करें. सेट डिटेक्टर ("एचवी", PMT वोल्टेज) संवेदनशीलता वांछित छवि (empirically परिभाषित) गुणवत्ता और धीरे - धीरे लेजर उत्पादन बढ़ा है जब तक छवि तीव्रता पिक्सेल संतृप्ति से बचने के लिए स्वीकार्य है के साथ संगत मान.
चैनलों के बीच crosstalk के लिए जाँच करें, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक लेजर लाइन उपयुक्त चैनल में केवल मैन्युअल पर लेज़रों मोड़ और बंद जबकि सभी इमेजिंग चैनलों की निगरानी के द्वारा detectable संकेत पैदा. को खत्म करने के लिए crosstalk लेजर शक्ति को कम. यदि कोई crosstalk स्पष्ट है, सभी चैनलों के साथ महत्वपूर्ण समय की बचत प्रदान करने के लिए अधिग्रहीत किया जा सकता है.
अपरिहार्य crosstalk की घटना में, एक "अनुक्रमिक" इमेजिंग मोड कि लेज़रों / चैनलों के बीच व्यक्तिगत स्विच का उपयोग करें. चरम मामलों में (उदाहरण के लिए, इमेजिंग GFP और YFP) अनुक्रमिक मोड भी है कि dichroic दर्पण और / या बाधा फिल्टर ("आभासी चैनल") स्विच का उपयोग की आवश्यकता होती है. नोट: इस विकल्प छवि अधिग्रहण की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण लौकिक देरी परिचय और हो एपी नहीं हो सकताअत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं पर कब्जा करने के लिए propriate.
"ज़ूम" और "रोटेशन" कार्यों के लिए आगे हित के क्षेत्र के फ्रेम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ज़ूम भी छवि संकल्प में सुधार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उद्देश्य और स्कैन स्वरूप की सीमा इस्तेमाल किया (उदाहरण के लिए, x 512 512 अप करने के लिए, इन मुद्दों के बारे में जानकारी के लिए देखते हैं http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res, . pdf).
के लिए सामान्य में vivo इमेजिंग में, और समय चूक इमेजिंग के लिए विशेष महत्व का है, तकनीक है जो phototoxicity मुद्दों (यानी, मुक्त कण के संचय) को कम करने पर जोर दिया जाना चाहिए, तेजी से स्कैन (उदाहरण के लिए, 2 μs / पिक्सेल) गति और कम लेजर उत्पादन स्तर (जैसे,% 1) जब भी संभव हो, के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए सबसे कम संकल्प स्कैन प्रारूप मुख्य जानकारी पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त है.
छवि संकल्प में सुधार करने के लिए, औसत स्कैन Kalman ("") के अधिग्रहण के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है. धीमी स्कैन गति भी संकल्प में सुधार है, लेकिन वृद्धि लेजर समय है, जो phototoxicity और विरंजन मुद्दों ख़राब होगा ध्यान केन्द्रित करना. ध्यान दें कि इन दोनों दृष्टिकोण के z-श्रृंखला, एक घटना हम "समय कलंक" कहते भर में तेजी से परिवर्तन पर कब्जा करने में असमर्थता के लिए संभावित कारण समय चूक के लिए आदर्श नहीं हैं. ध्यान दें कि लाइन द्वारा फ्रेम बनाम द्वारा औसतन एक एकल विमान के भीतर नहीं बल्कि z-गहराई भर "समय कलंक" मुद्दों को खत्म करने में मदद कर सकते हैं.
यदि संकेत तीव्रता कम कर रहे हैं और अधिकतम छवि संकल्प (उदाहरण के लिए, बस सेल नंबर की गिनती) की आवश्यकता नहीं है, confocal एपर्चर (pinhole व्यास) बढ़ाने सिग्नल को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह लेजर तीव्रता को कम रखने में कार्य करता है, phototoxicity कम करने और विरंजन, लेकिन एक मूल्य 1 हवादार यूनिट से अधिक छवि गुणवत्ता में तेजी से नुकसान की ओर जाता है है एपर्चर समायोजन.
Z-गहराई एक तेजी से स्कैन मोड ("फोकस x4") का उपयोग आयाम परिभाषित करें. क्योंकि संकेत तीव्रता z-गहराई यह सबसे अच्छा है z-ढेर अधिग्रहण न्यूनतम गहराई और सबसे सतही अंत में शुरू के साथ आम तौर पर कम हो जाती है, यह और अधिक कठिन संकेतों पहले विरंजन महत्वपूर्ण होता है अधिग्रहीत करने की अनुमति देता है.
छवि की गहराई भर पर्याप्त संकेत पता लगाने के लिए जाँच करें. अगर वांछित, एक चमक z आयाम सुधार समारोह ("तेज Z") निर्दिष्ट गहराई में छवि अधिग्रहण पैरामीटर को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार z आयाम कदम आकार सेट करें. उदाहरण के लिए, हमारा पहला उदाहरण (चित्रा 1) में हम केवल व्यक्तिगत retinas में लगातार दिन में एक 'सेल जनगणना' लेने के इस तरह हम 15 माइक्रोन के लिए z गहराई सेट और रेटिना के प्रति पांच से सात छवियों लिया. यह रणनीति हमें छवियों के बीच कोई सेलुलर ओवरलैप के साथ प्रत्येक रेटिना नमूना करने की अनुमति दी. हमारा दूसरा उदाहरण में (चित्रा 2), हम तेजी से 4D समय चूक फिल्मों GFP और mCherry जरूरत spatially सहसंबद्ध किया जा संकेतों, जिसमें इस तरह हम तीन बार सैद्धांतिक पार्श्व एक समझौता है जो z-ढेर छवियों की अनुमति दी संकल्प कदम आकार सेट प्रदर्शन हर 5-10 मिनट ले लिया हो लेकिन अभी भी व्यक्तिगत सेलुलर विस्तार को हल करने के लिए सेवा.
छवियों मोल XYLZt ("") और बचाने. पर अगले मछली हटो अगर एक सीरियल प्रयोग समय चूक (# नीचे 4 देखें) प्रदर्शन. तेजी के लिए समय चूक इमेजिंग नीचे # 5 देख.

4. सीरियल 'पकड़ो और रिलीज' इमेजिंग: के बाद एक दिन से अधिक व्यक्तिगत मछली में सेलुलर परिवर्तन ट्रैकिंग के लिए एक विधि

ए 'को पकड़ने और रिलीज' प्रोटोकॉल समय मछली की मात्रा को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है स्थिर करने के लिए और प्रयोग के प्रति imaged मछली की संख्या में वृद्धि. इस तकनीक की उपयोगिता जैविक प्रक्रियाओं जो दिन में प्रकट करना (जैसे, Mumm एट अल. +२,००६ ²⁾ करने के लिए सीमित है. इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि किसी भी मनाया परिवर्तन आंतरिक नियंत्रित किया जा करने की अनुमति देता है, यानी, व्यक्तियों के विभिन्न राज्यों के बीच के बजाय आबादी के पार, तुलना. उदाहरण के लिए, लेबल कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन ट्रैकिंग दिया ऊतकों में उपस्थित सही किया जा सकता है है भले ही शुरू लेबल कोशिकाओं की संख्या व्यक्तिगत मछली के बीच बहुत भिन्न होता है. यहाँ एक सेल prodrug प्रेरित पृथक ^3,5 परख के संदर्भ के भीतर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए तरीके प्रदान की जाती हैं .
पृथक और समय पर अलग - अलग मछली में लक्षित सेल प्रकार के उत्थान कल्पना, confocal छवियों prodrug प्रशासन (पूर्व उपचार) के लिए पहले अर्जित कर रहे हैं तुरंत prodrug (उपचार के बाद) को हटाने और वसूली अवधि (रिकवरी छवियों) के दौरान निम्नलिखित,.
पूर्व उपचार इमेजिंग: मछली घुड़सवार और ऊपर के रूप में imaged. एक बार मछली imaged किया गया है कि वे भ्रूण माध्यम में जारी कर रहे हैं (+ prodrug) और 28.5 पर incubated डिग्री सेल्सियस इमेजिंग डाक उपचार सत्र तक. दो की टीमों में काम करते हुए, बढ़ते और मछली जारी, अन्य इमेजिंग एक अच्छा तरीका करने के लिए मछली की संख्या है कि प्रति दिन imaged किया जा सकता को अधिकतम है.
इमेजिंग के बाद एक ही डिश में सभी मछली भ्रूण भ्रूण मध्यम अकेले (- PTU + /) के साथ tricaine युक्त मध्यम जगह.
मछली रिहाई के लिए, जौहरी संदंश का उपयोग लार्वा के दोनों पक्षों पर agarose माध्यम से काटा और फिर धीरे दूर तंग agarose जब तक मछली भ्रूण माध्यम में स्वतंत्र रूप से तैरता है.
Prodrug प्रेरित पृथक: एक multiwell भ्रूण (+ / - PTU) मध्यम युक्त थाली के एक अच्छी तरह से व्यक्ति में स्थानांतरण लार्वा + prodrug (जैसे 10mm metronidazole, MTZ). सटीक अंतिम prodrug सांद्रता सुनिश्चित हम आम तौर पर विभाज्य भ्रूण माध्यम से एक निर्धारित मात्रा (+ / - PTU) प्रत्येक कुएं में prodrug की एक 2X एकाग्रता (जैसे, 20 मिमी) से युक्त. मछली तो भ्रूण के माध्यम से एक बराबर मात्रा (+ / - PTU) में कुओं को जोड़ा 1X के लिए अंतिम prodrug एकाग्रता लाने के.
28.5 पर सेते डिग्री सेल्सियस जब तक लक्षित सेल पृथक सत्यापित किया जा सकता है.
नोट: prodrug उपचार regimens के सफल पृथक प्राप्त करने की आवश्यकता सेल लक्षित प्रकार के अनुसार बदलती हैं, prodrug एकाग्रता और उपचार की अवधि empirically निर्धारित किया जा आवश्यकता होगी, पता है कि उच्च सांद्रता सामान्य विषाक्तता, उदाहरण के लिए,> 10 मिमी MTZ कारण. इसके अलावा, खंडित संवाददाता संकेतों के perdurance पृथक सफलता के आकलन confocal माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त रूप से सेल हानि की कल्पना की आवश्यकता है कुछ उदाहरणों में, जटिल हो सकता है.
डाक उपचार इमेजिंग: मछली बढ़ रहे हैं जैसे कि एक ही ऊतक बेहतर उन्मुख है और इसके बाद के संस्करण के रूप में imaged है. एक बार एक दिया प्लेट पर सभी मछली imaged किया गया है कि वे भ्रूण मध्यम (+ / - PTU) में जारी कर रहे हैं और व्यक्तिगत कुओं (जैसा ऊपर) में 28.5 पर incubated डिग्री सेल्सियस ablated कोशिका प्रकार के उत्थान की अनुमति के लिए.
मछली और वसूली के लिए आवश्यक समय की उम्र के आधार पर यह परख के इस चरण के दौरान मछलियों को खाना खिलाना आवश्यक हो सकता है. हम paramecia या रोटीफर्स जैसे रहते भोजन का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम अस्तित्व. यह भी ताजा मीडिया दैनिक प्रदान करना उचित है, खासकर अगर मछली कम मात्रा (जैसे, 96 अच्छी तरह प्लेटें) में रखा जाता है.
वसूली इमेजिंग: सेल प्रतिस्थापन के कैनेटीक्स दस्तावेज़, मछली वसूली अवधि के दौरान एक दैनिक आधार पर imaged किया जा सकता है. एक बार कैनेटीक्स स्थापित किया गया है परख केवल ब्याज के समय अंक (उदाहरण के लिए, पूरी वसूली) पर वसूली छवियों को प्राप्त करने के द्वारा सरल किया जा सकता है है. चित्रा 1 रेटिना सेल पुनर्जनन के हमारे अध्ययन से इस दृष्टिकोण का एक उदाहरण प्रदान करता है.
प्रयोग मछली के समापन पर बर्फ पर 20X tricaine समाधान (15.3 सुक्ष्ममापी) में विसर्जन से euthanized किया जाना चाहिए.

5. रैपिड इमेजिंग समय चूक.

तेजी से समय चूक कई fluorphores इमेजिंग (यानी, 'फिल्में') के लिए तकनीक है जो phototoxicity मुद्दों को कम महत्वपूर्ण हैं (ऊपर देखें). जैसा कि ऊपर कहा गया है है, इस तकनीक का सबसे अच्छा युगपत अनुमति fluorphores के लिए अनुकूल है, अनुक्रमिक बजाय, इमेजिंग
28.5 पर मछली बनाए रखें डिग्री सेल्सियस एक गर्म चरण, आईटीओ कांच हीटिंग तत्व है, या इसी तरह का उपयोग कर.
तरीकों का उपयोग करें, जो वाष्पीकरण को कम करने में मदद के लिए स्थिर तापमान और osmolarity (उदाहरण के लिए, उलटा माइक्रोस्कोप के लिए O-अंगूठी सील coverslips).
बढ़ाया अधिक बार स्वचालित अधिग्रहण का उपयोग कर यदि ढेर आकार सेट करने के लिए विकास और / या z आयाम में बहाव के लिए अनुमति देने के लिए सुनिश्चित हो.
समय अंतराल सेट और स्कैन की संख्या ("TimeScan" या "TimeController"). अधिग्रहण दरों empirically जैविक imaged और / या ब्याज की सेल की आबादी का phototoxic संवेदनशीलता गुण अनुसार समायोजित प्रक्रिया की गतिशीलता के अनुसार स्थापित किया जा आवश्यकता होगी.
छवियों मोल ("XYLZt" बटन) और बचाने.
'फ़िल्म' का निर्माण करने के लिए, हित के क्षेत्रों को परिभाषित और x, y, और z आयाम में गठबंधन होने की आवश्यकता होगी. पूरी प्रक्रिया इस प्रोटोकॉल समीक्षा के दायरे से परे है, लेकिन कई सॉफ्टवेयर प्रोग्राम उपलब्ध हैं जो भी 4D छवि विधानसभा (Volocity, Amira, आदि) के दौरान ज़ूम, रोटेशन, और panning के कार्यों की सुविधा.

6. वर्णक्रमीय पृथक्करण छवि प्रसंस्करण Imagej फ्रीवेयर का उपयोग

बेहतर, जब एक पत्रकार बहु इमेजिंग प्रयोग प्रदर्शन यह सबसे अच्छा है कि अच्छी तरह से अलग हो रहे हैं spectrally fluorphores उपयोग. हालांकि, यह हमेशा व्यावहारिक और / या संभव नहीं है. यहाँ हम fluorphores कि उत्तेजना और उत्सर्जन प्रोफाइल अतिव्यापी है, इस मामले GFP और YFP में अलग करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करते हैं. दिए गए उदाहरण में, हम इस्तेमाल किया है, समय चूक इमेजिंग तकनीक ऊपर वर्णित GFP लेबल रेटिना 'स्टेम कोशिकाओं', मुलर glia के व्यवहार को ट्रैक करने के लिए लक्षित पृथक और रेटिना द्विध्रुवी कोशिकाओं के उत्थान YFP और एनटीआर - mCherry के साथ लेबल के दौरान, (चित्रा 2).
अनुक्रमिक इमेजिंग मोड और चर बाधा फिल्टर है कि अतिव्यापी fluorophores स्वतंत्र रूप से प्राप्त करने के लिए और आंशिक रूप से अलग, क्रमशः (GFP / YFP सेटिंग्स उदाहरण के लिए ऊपर देखें) की अनुमति छवियों का उपयोग कर ले लीजिए. Crosstalk हटायें हम एक सरल छवि घटाव रणनीति है जो एक दूसरे से चैनलों के संकेत हटा का उपयोग करें.
छवि घटाना प्रक्रिया: जमानाImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html) के नवीनतम संस्करण, loci उपकरण जैव स्वरूप (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) , और ढेर (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html) प्लग में संरेखित करें.
Loci में जैव स्वरूपों आयात प्लग का उपयोग करने के लिए छवि फ़ाइलों को खोलने के, बस ImageJ खिड़की पर ब्याज की फाइल खींच आयात उपकरण शुरू होगा. व्यक्तिगत लोड करने के बाद "चैनल उपकरण" (+ Ctrl + z बदलाव) के तहत आयात विंडो में चेकबॉक्स "भाजित चैनल" या "भाजित चैनल" टैब का उपयोग ढेर में चैनलों भाजित.
प्रारंभ 3 टी.पी. प्लगइन (plugins के> संरेखित ढेर> संरेखित 3 टी.पी.) संरेखित करें. ढेर करने के लिए उचित घटाव सुनिश्चित करने के लिए गठबंधन किया जाना चाहिए. पहली ड्रॉपडाउन बॉक्स में और दूसरे में गलत गठबंधन स्टैक संदर्भ ढेर का चयन करें. "का उपयोग xy रिश्तेदार मूल" और "का उपयोग z रिश्तेदार मूल" बक्से की जाँच करें और क्लिक करें "ठीक है".
संरेखण की प्रक्रिया शुरू करने के लिए, "वॉल्यूम पंजीकरण" बटन पर क्लिक करें. एक नई विंडो दिखाई देगा कि संरेखण पैरामीटर शामिल हैं. यह खंड प्लगइन के वितरक द्वारा ऑप्टिमाइज़ किया गया है, कोई परिवर्तन आवश्यक हैं, बस क्लिक करें "ठीक है".
जब समाप्त हो, एक "गठबंधन के ढेर" खिड़की दिखाई देगा. विंडो संरेखित से "आउटपुट" का चयन करें और आउटपुट विंडो दिखाई देनी चाहिए. इस विंडो को भी अनुकूलित है और कोई संशोधन की जरूरत है. "ठीक" क्लिक करें. "गठबंधन" फ़ाइल शीर्षक के अंत करने के लिए संलग्न के साथ एक नया ढेर काम अंतरिक्ष में दिखाई देनी चाहिए.
Crosstalk "छवि कैलक्यूलेटर" (प्रक्रिया> छवि कैलक्यूलेटर) का उपयोग कर हटा दिया जाएगा. छवि 1 ड्रॉपडाउन बॉक्स और ढेर Image2 ड्रॉपडाउन बॉक्स में घटाव में इस्तेमाल में subtracted ढेर का चयन करें. ऑपरेशन ड्रॉपडाउन बॉक्स में "घटाएँ" का चयन करें और क्लिक करें "ठीक है". ImageJ के लिए ढेर प्रक्रिया से पूछते हैं, का चयन करेंगे "हाँ". एक नया ढेर प्रकट करना चाहिए जो अतिव्यापी चैनल के बीच crosstalk हटा दिया गया है.
पहले संरेखण और घटाव के ढेर विलय होने की जरूरत करने के लिए एक ही छवि संरचना विश्राम. चैनल उपकरण विंडो में मर्ज चैनल "का चयन करें. उपकरण आप एक hyperstack में चार ढेर मर्ज करने के लिए अनुमति देगा.
नोट: वांछित जोड़ना उपकरण (छवियों> ढेर उपकरण> जोड़ना>) का उपयोग करने में अधिक से अधिक 4 के ढेर, जुटना ढेर विलय. एक hyperstack (छवियों> hyperstack> hyperstack ढेर) concatenated ढेर में कनवर्ट. ढेर के संयोजन गहराई, समय, चैनल के आदेश (zct), यह करने के लिए ड्रॉपडाउन बॉक्स में जो प्रकट होता है के भीतर रीसेट की जरूरत है परिवर्तन, xyztc "आदेश" सेट, "चैनल" सेट, के अनुसार "स्लाइसें" और "फ्रेम" ढेर, ढेर की गहराई, और समय अंकों की संख्या, क्रमशः की संख्या ...
अंत में, सभी चैनलों colorized, चमक और विपरीत समायोजित, और झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेजा की जरूरत है. यहाँ से, आरजीबी, संग्रथित चित्र, z प्रक्षेपण, या समय की श्रृंखला के लिए रूपांतरण मूल फ़ाइलों के लिए के रूप में एक ही प्रक्रिया है.

7. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1. Confocal लक्षित घटाने और एनटीआर mCherry के उत्थान रेटिना द्विध्रुवी कोशिकाओं (लाल कोशिकाओं) व्यक्त प्रदर्शन छवियों की एक श्रृंखला समय चूक. एक और एक ') पहले इलाज के लिए झिल्ली "नियंत्रण" द्विध्रुवी कोशिकाओं, पीले रंग में दिखाया गया है, और nitroreductase चेरी "लक्षित" लाल रंग में दिखाया bipolars में संलयन प्रोटीन में टैग YFP रिपोर्टर के मोज़ेक अभिव्यक्ति है. B & B ') के साथ के बाद उपचार metronidazole, लाल nitroreductase व्यक्त द्विध्रुवी कोशिकाओं, खो दिया है, जबकि पीले "नियंत्रण" द्विध्रुवी कोशिकाओं, बच रहे हैं. यह इस पृथक पद्धति का अत्यधिक विशिष्ट प्रकृति को दर्शाता है. सी और सी ') जब metronidazole निकाल दिया जाता है, एनटीआर-व्यक्त कोशिकाओं (लाल) वापसी.

चित्रा 2 छवि घटाव प्रक्रिया है कि GFP और YFP सफाई निम्नलिखित अधिग्रहण अलग अनुमति देता है की एक उदाहरण प्रदान करता है. एक और ए) घटाव, GFP () हरे और YFP (pseudocolored बैंगनी) छवियों से पहले 'गठबंधन कर रहे हैं. B & B) घटाव प्रक्रिया YFP लेबल द्विध्रुवी कोशिकाओं GFP छवि से हटाया जा करने की अनुमति देता है, GFP लेबल मुलर glia और अधिक आसानी से पता लगाया जा करने के लिए अनुमति. सी एंड सी) (हरा) GFP और mCherry (लाल) के सह - अभिव्यक्ति स्पष्ट है में सेल तीर द्वारा संकेत है. क्योंकि मुलर glia सेल मार्कर और द्विध्रुवी सेल मार्कर के सह - अभिव्यक्ति पता चलता है कि द्विध्रुवी सेल पृथक मुलर के लिए खो दिया कोशिकाओं की जगह glia चलाता है. यह व्याख्या रेटिना उत्थान जो चोट प्रेरित दोनों स्तनधारियों और मछली में 'स्टेम कोशिकाओं' के रूप में मुलर glia फंसाना के हाल ही के अध्ययन के साथ ध्यान में रखते हुए है.

Discussion

इस वीडियो में, हम बहुरंगा इमेजिंग confocal समय चूक और लक्षित सेल पृथक के लिए उपयोग तकनीकों के एक सिंहावलोकन प्रदान की जाती है. हम समय चूक इमेजिंग रोजगार vivo में ब्याज की कई प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार पर नजर रखने, जबकि लक्षित सेल पृथक करने के लिए तंत्रिका सर्किट समारोह और सेल विशिष्ट neuronal उत्थान मानदंड का अध्ययन किया है. उदाहरण दिखाया कई फायदे है कि इन तरीकों से gleaned जा सकता है है पर प्रकाश डाला. शायद सबसे महत्वपूर्ण, समय चूक इमेजिंग एक आंतरिक नियंत्रित प्रतिमान प्रदान करता है, किसी भी और सभी घटना मनाया पिछले राज्यों को वापस संबंधित कर सकते हैं. यह बजाय सीधे inferred तुलना प्रयोगात्मक समय अंक भर में किया जा करने के लिए, सापेक्ष परिवर्तन करने के आसान और यों प्रयोगात्मक 'शोर' एक आबादी के भीतर बदलाव के साथ जुड़े को कम करने की अनुमति देता है. बहुरंगा इमेजिंग का एक लाभ यह बातचीत और / या पड़ोसी सेल प्रकार में परिवर्तन की कल्पना करने की क्षमता है. उदाहरण के लिए, एक ट्रांसजेनिक लाइन है जो मुलर glia लेबल का उपयोग करते हुए, अब हम असतत रेटिना सेल subpopulations के नुकसान के लिए इन संभावित चोट प्रेरित स्टेम कोशिकाओं की प्रतिक्रिया निस्र्पक हैं. हम भी इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल करने के लिए तंत्रिका सर्किट ² गठन के उपन्यास तंत्र को परिभाषित . अंत में, सेलुलर उत्थान के अध्ययन के अलावा, हम हाल ही में एनटीआर आधारित पृथक प्रणाली का उपयोग करने के लिए neuronal subtypes के कार्यात्मक भूमिका के इस प्रकार असतत तंत्रिका सर्किट का उपयोग कर विभिन्न व्यवहार मानदंड और electrophysiological assays की जांच शुरू कर दिया है. इस तरह के अध्ययन के लिए zebrafish रोजगार के अद्वितीय लाभ यह है कि, उनके पुनर्योजी क्षमता की वजह से, प्रेरित घाटे अस्थायी हैं. इस प्रकार, समय चूक इमेजिंग assays के साथ correlating द्वारा हम reinnervation तंत्र है कि के लिए सीसा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, कार्यात्मक वसूली के लिए आवश्यक reinnervation की हद तक पाई जाती हैं कर सकते हैं.

प्रदान तरीकों कई अलग अलग सवाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, पृथक और उत्थान के समान विश्लेषण किसी भी transgenically definable सेलुलर उप प्रकार लागू किया जा सकता है. सामूहिक रूप से, इस तरह के अध्ययन के लिए अलग - अलग सेल प्रकार के स्तर पर और असतत स्टेम सेल niches के भीतर उत्थान के बारे में हमारी समझ का विस्तार करने की क्षमता है.

Disclosures

JSM zebrafish में nitroreductase आधारित सेल पृथक की प्रणाली (Mumm जे एस, और Schroeter, एह Zebrafish "अमेरिकी पेटेंट 7514595 में लक्षित और क्षेत्रीय एबलेशन सेलुलर एबलेशन 7 अप्रैल 2009) के प्रयोग पर एक पेटेंट सम्मानित किया गया है इस तकनीक है. एक उपकरण और सेवाएं जैव प्रौद्योगिकी कंपनी, Luminomics, इंक, कि JSM और स्थापना के लिए सामान्य मंच के रूप में इस्तेमाल किया अंदर एक हितधारक रहता है

Acknowledgments

हम डीआरएस धन्यवाद. मीरा सक्सेना और पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए जोनाथन Mathias. हम डीआरएस धन्यवाद. माइकल पार्सन्स, पामेला रेमंड, और राहेल वाँग ट्रांसजेनिक लाइनें प्रदान करने के लिए. जानवरों पर प्रयोग मिलीग्राम IACUC द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार 07-12-003 प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी में प्रदर्शन किया गया * बी इस काम JSM R21 MH083614 NIH और मार्च ऑफ डाइम्स तुलसी ओ कोनर स्टार्टर विद्वान पुरस्कार के द्वारा समर्थित किया गया

Materials

1. Reagents:
Danieau's solution:
sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)
Other reagents:
Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)
2. Supplies:
Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)
3. Equipment:
Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).