Summary
이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데 사용됩니다
Abstract
살아있는 zebrafish의 애벌레의 고해상도 시간 경과 영상은 방법을 생물 학적 과정이 (검토를 위해 1 참조) 펼쳐 시각화에 활용하실 수 있습니다. 이웃 세포 유형에서 다른 형광 기자를 표현 화합물 유전자 변형 물고기는 시간이 지남에 따라 실험적인 조작을 세포 상호 작용이 및 / 또는 조직 수준의 답변을 다음과 같은 수단을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 며칠 분 거리에 걸쳐 수있는 시간이 코스를 통해 각각의 물고기에 순차적으로 이미징 여러 transgenically 표시 셀 유형에 대해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. ) 분리에 대한 단순화된 접근 방식 1) 직렬 '잡으 및 릴리스'이미징을위한 방법 연속 일, 2 이상의 물고기가 많은 : 설명 기술을 포함하여, 시간이 지남에 인접한 세포 유형의 "행동"을 상호 연관하고자하는 모든 연구에 적용 중복 여기 / 방출 프로파일 (예 : GFP 및 YFP), 3) 개발, 4 후반 애벌레 단계로 고해상도 이미징을위한 시간 창 사용할 수 연장 hypopigmented 돌연변이 라인의 사용) 형광 기자가 공개를 타겟으로 막의 사용 fluorophores 개별 세포뿐만 아니라 세포의 큰 인구에있는 세포 자세한 내용 및 transgenically 타겟 세포 유형의 화학을 이용한 절제 5) 이전에 설명한 방법을 잘 형태학의 세부 사항; 같은 메트로니다졸 같은 즉, nitroreductase (NTR) prodrug 기판의 중재 변환, (MTZ), 세포 독성 파생 3,5 수 있습니다.
이러한 접근 방법의 예를 들어, 우리는 며칠 동안 개별 생선 이내에 망막 신경 세포 양극성의 subtype의 절제와 재생을 시각화합니다. 동시에 우리는 이웃 아닌 타겟 바이폴라 전지 및 잠재적인 변성 자극 망막 줄기 세포 (즉, Mϋller의 glia)을 포함한 여러 다른 망막 세포 유형을 모니터합니다. 이 전략은 타겟의 연결을 세포 유형의 선택 상실과 재생을 세포 및 조직 수준 (예를 들어, 줄기 세포 틈새) 응답을 특성화하기 위해 실험실에 적용되고 있습니다.
Protocol
1. 유전자 변형과 돌연변이 선
- differentially 형광 리포터 변종으로 표시 관심 세포 유형이 유전자 변형 zebrafish 라인을 설정 / 취득. 최적 선택한 기자의 여기 / 발광 프로필 최소한의 중복 (예 : ECFP 및 EYFP)해야하지만 이것은 절대적으로 필요하지 않습니다. 우리 목적을 위해서도 막의 사용은 크게 대규모 comingled 그룹에서 개별 세포 숫자 및 / 또는 morphologies를 해결하기 위해, 같은 neuritic 프로세스로 미세 세포 자세한 내용의 영상을 용이하게 다음과 같은 높은 막 콘텐츠의 영역을 '강조'에 형광 기자도 곁에 시냅스 neuropils.
- 늦은 애벌레 단계에서 영상을 위해, 그것이 파생 / 착색을 감소 돌연변이 배경으로 유전자 변형 라인을 건너 도움이됩니다 [예, 로이 오비슨 (로이) 또는 로이 오비슨, (; 장백의 로이); 흰둥이 4]. 우리의 경험에서 iridiphores의 감소 (예 : 로이)가 가장 중요한 문제이며, melanogenesis는 화학적으로 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU) 또는 melanophores 부족 "흰둥이"돌연변이로를 사용하여 해결하실 수 있습니다. 르네 외. 4, 시각 결손 및 melanaphores이 부족해 물고기의 망막에있는 겸손한 형태학의 변화를 보여주는 것을 그러나주의, 그리고 강렬한 빛은 "흰둥이"돌연변이의 photoreceptor 죽음을 유도하실 수 있습니다. 따라서, 이러한 문제는 이미징 실험 및 / 또는 해석 데이터를 디자인할 때 고려해야합니다.
- 이 예제의 경우, 사용되는 유전자 변형과 돌연변이 물고기 라인되었습니다
- TG (닉스 : Gal4 - VP16) q16a / +; TG (UAS : gap43 - YFP) q16b / +; TG (UAS - E1b : NfsB - mCherry) c264 / +; TG (pax6 - DF4 : gap43 - CFP) q01 / +; 로이 a9/a9
- 참고 : 물고기 "1", 닉스 - 프로 모터의 subpopulation이 정의 망막 바이폴라 전지는 (대부분의 특급 모두) 막 - 태그 YFP 및 / 또는 NTR - mCherry 퓨전 기자를 표현하고, 거의 모든 망막 세포는 멤브레인 - 태그 CFP를 표현 . 멀러 glia 세포가 cytosolic GFP를 표현하고 세계 망막 CFP 표현이 제거되었습니다 제외 물고기 "2"로 위에있다. NTR - mCherry 융합 표현 prodrug 유발 절제 3,5 쉽습 닉스 정의 양극성 세포를 렌더링.
2. 선택 및 라이브 영상에 대한 태아 / 애벌레 준비
- 메이트 형질 / 관심 돌연변이 라인은 28.5에서 달걀을 수집하고 부화 / 유지 ° 0.3X Danieau의 솔루션에 C (또는 선택의 '배아 매체').
- 없다 "흰둥이"배경으로한다면, PTU 전에 관심있는 조직 (예 : 눈 ~ 16 HPF, 200 μm의 최종)에 착색의 증거 tyrosinase 활동을 억제하기 위해 추가되어야합니다. 75 μm의를 초과하는 농도에서 PTU와 치료 독성 및 / 또는 teratogenic 효과를 일으킬 수 있습니다. 눈이 높은 색소이기 때문에 그러나, 200 μm의 아래의 트리 트먼트는 고해상도 공촛점 이미징에 적합하지 않습니다, 이러한 조건 하에서 그것은 이미징을위한 건강 찾는 물고기를 선택하는 것이 중요합니다. 이미징 다른 조직의 경우, 75 μm의 PTU은 바람직있을 수 있습니다. 또한, 위에서 언급, PTU와 배아를 치료의 필요성을 obviates과 늦은 애벌레 단계에서 이미지에 대한 선호하는 전략이다 "흰둥이"돌연변이 라인 중 하나를 사용하십시오.
- 일단 형광 기자 형광 스테레오 줌 현미경 또는 이와 유사한 표현을 사용하고 일반적인 건강을 transgene에 따라 분명, 정렬 물고기입니다.
- 이전 이미지의 첫날에, 40에서 솔루션, 저장에 들어갈 0.5 %, 열 및 믹스의 최종 농도 배아 매체 낮은 용융 아가로 오스 (LMA)를 해산 ° C.를
- 영상의 첫날에 장착 솔루션 준비 : 배아 매체 0.5 % LMA에 추가 tricaine (756 μm의 최종 마취)와 PTU를 (필요한 경우), 부드럽게 믹스, 그리고 40 ° C.으로 돌아갑니다
- PTU 및 / 또는 tricaine을 포함하는 배아 매체에 전송하여 물고기를 마취, 물고기를위한 시간 (~ 3 분) 터치 비 응답이 될 수 있습니다.
- 그것이 재사 용할 수 있도록 아가로 오스를 희석하지 돌보는, 장착 솔루션으로 개별 물고기를 전송합니다. 우리는 전송 손질 팁있는 micropipette를 사용하여, 이것은 또한 제어 볼륨을 (~ 30 μL) 유지하는 데 도움이됩니다. 피펫 반전, 인수와 물고기 장착 솔루션 팁을 감동해도 액체를 풀다 필요없이 중력 전송을 허용 있도록 바닥에 정착하게되면.
- 전송 후, micropipette에서 마취 솔루션을 추방하고 페트리 접시에 장착 솔루션 ~ 30 μL 비말에있는 물고기를 전송로를 사용합니다.
참고 :이 설치 방법은 긴 작동 거리 물 침지 목표가 사용됩니다 직립 현미경에만 관련됩니다. 날 위해서coverslips이 필요 거꾸로 현미경에 관련 thods는 안데르센 외보고 2010;. 오브라이언 외, 2009;. 2009 Graeden과 Sive. - 40 ° C 가열 블록에 장착 솔루션을 반환합니다.
- 속눈썹 브러쉬 또는 유사한를 사용하면 부드럽게 원하는 방향과 위치 아가로 오스의 비말의 중심에 대한 관심의 영역으로 생선을 돌린다.
- 요리마다 배아의 원하는 숫자를 탑재 6-10 단계를 반복합니다. 시리얼 시간 저속 실험 (아래 참조) 우리는 일반적으로 한번에 6 생선을 탑재하고 그룹마다 1 시간 이미징 세션을 제한하려고합니다.
- 설치 다른 물고기 이전 과목 아가로 오스 굳은 (~ 3 분)까지 원하는 방향을 유지하는지 확인하기 위해 다시 확인해 동안.
- 아가로 오스가 확정되면, 공촛점 현미경 단계에 생선을 수송하고 모든 물고기가 완전히 빠져들 때까지 부드럽게 요리에 PTU 및 / 또는 tricaine을 포함하는 배아 매체를 추가합니다.
3. 생체내 공촛점 이미징에서 "여러 가지 빛깔의"
참고 : 우리가 다른 현미경 구성에 대한 관련 정보를 제공하는 등 아래의 프로토콜을 일반화하기 위해 노력했다. 올림 퍼스 앤드 ImageJ 소프트웨어 응용 프로그램에 특정 참조는 따옴표에 있습니다. 우리의 이미징 시스템은 405을 갖춘 올림푸스 FV1000 수직 공촛점 현미경, 440, 488, 515, 559 및 635 nm의 레이저, 두 변수 장벽 필터 검색 채널 (발광 파장 설정이 1 나노미터 단위로 조정할 수 있도록), 하나의 표준 장벽 필터 채널 (빨간색과 멀리 붉은 영상) 및 하나는 빛을 채널을 전송.
- 이미징 소프트웨어를 여십시오 ( "FV10 - ASW")와 관심의 영역을 찾습니다하거나 전송 또는 형광등 광원을 사용합니다. 셀룰러 및 / 또는 분자 높은 NA (예 : 60X, 1.2NA)와 세부 사용 긴 작동 거리 목표 최적의 영상을 보려면.
- 전송 빛의 이미지를 수집하는 경우, 콜러 조명에 대한 필드 다이어프램을 중점을두고 있습니다.
- "다이 목록"에서 해당 fluorphores를 선택하거나 이전에 저장한 이미지 파일에서 수집 매개 변수를로드합니다. 배출 범위 조정 ( "스펙트럼 설정") 기자 신호 및 / 또는 잡음 비율로 최대한의 신호 분리 세척에 필요한하십시오. 이러한 설정은 경험적으로 누화를 최소화하지만, 신호를 최대화하기 위해 각 실험에 대해 정의해야합니다, 여기에 제공된 예제에 대한 설정은 다음과 같습니다 :
Flourphores 레이저 (NM) 배리어 설정 / 배출 필터 (NM) 1) ECFP, EYFP, mCherry는 * 440, 515, 559 * 460-500, 530-545, 575-675 2) EGFP ** EYFP ** mCherry 488, 515, 559 500-515, 530-545, 575-675
mCherry의 * 영상은 높은 파장 레이저 (예 : 568 또는 594 nm의)를 사용하여 향상 될 수
** 이색성 거울 장벽 필터를 변경 ( "가상 채널") 허용 순차 이미징 모드 GFP와 YFP 사이에 방사 / 여기 중복으로 인해 필요합니다. GFP와 mCherry는 별도의 채널에 하나의 채널, YFP에 할당할 수 있습니다. 참고 : GFP 및 YFP 이미지 사이의 누화 이전 이미지 빼기 (6 부)에 분명합니다. - 사용되는 목적은 정의 사전 설정을 제대로 조정되는 소프트웨어를 보장하기 위해 드롭 다운 메뉴에서 선택되어 있는지 확인하십시오.
- 레이저와 설정 전원 레벨을 집중하기 위해 각 채널에 대해 ( "하이로") 픽셀의 채도를 보여 테이블 최대보세요 (LUT)를 선택합니다. 설정 검출기 감도 ( "HV", PMT 전압) 원하는 이미지 품질 (경험적으로 정의) 및 이미지 강도가 픽셀 채도를 방지 허용 때까지 점차적으로 레이저 출력을 높이와 일치하는 값으로.
- 채널 간의 누화를 확인, 각 레이저 라인이 모든 영상 채널을 모니터링하면서 수동에 레이저를 돌려 해제에 의해서만 해당 채널에 감지 신호를 생성되었는지 확인합니다. 누화는 레이저의 전원을 줄이기 제거합니다. 더 크로스 토크가 분명하지 않으면, 모든 채널이 동시에 상당한 시간 절감 효과를 제공 취득하실 수 있습니다.
- 피할 수 누화의 경우, 개별적으로 레이저 / 채널 사이의 스위치를 "선형"이미징 모드를 사용합니다. 극단적인 경우 (예, 영상 GFP 및 YFP)도 이색성 거울 및 / 또는 장벽 필터를 ( "가상 채널") 스위치를 순차 모드의 사용을 필요로합니다. 참고 :이 옵션은 이미지 수집 과정에 상당한 시간적 지연을 소개하고 AP 수 없습니다매우 역동적인 프로세스를 캡처 propriate.
- "확대"및 "회전"기능이 더욱 관심의 영역을 프레임에 사용할 수 있습니다. 확대도 접속 (예 : 512 X 512 사용 목적 및 스캔 형식의 한계로 이미지 해상도를 향상시키는 데 사용될 수 있습니다, 이러한 문제에 대한 자세한 내용은 참조 http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . PDF).
- 일반적으로 생체내 이미징에서, 그리고 시간 경과 이미징을 위해 특히 중요, phototoxicity 문제 (즉, 자유 래디 칼의 축적) 최소화 기술은 강조해야합니다, 빠른 스캔 속도 (예, 2 μs / 픽셀)과 낮은 레이저 출력을 가능한 수준 (예, 1 %)가 돌출 정보를 캡쳐를위한 적절한뿐만 아니라 가장 낮은 해상도 스캔 형식 사용해야합니다.
- 이미지 해상도를 높이려면 수집하는 동안 사용할 수 있습니다 ( "칼만") 평균을 검사합니다. 느린 스캔 속도는 해상도를 향상지만 증대 레이저 phototoxicity 및 표백 문제를 증명했다됩니다 시간을 머물러. 이러한 방식을 모두 Z - 시리즈, 우리는 "시간 부분"라고 현상에 걸쳐 급속한 변화를 캡처하는 무능력에 대한 잠재적으로 인해 시간 경과에 이상적되지 않습니다. 온라인으로 비교하여 평균 프레임 것은 하나의 비행기 내에서 아니지만 Z - 깊이에 걸쳐 "시간 흐림"문제를 제거하는 데 도움 수 있습니다.
- 신호 강도가 낮으 및 최대 이미지 해상도는 공촛점 조리개 (핀홀 직경)을 증가 (예, 단순히 세포 숫자를 계산)가 필요하지 않은 경우는 신호를 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 그러나 이상 한 통풍 장치가 이미지 품질 급격한 손실로 연결 값으로 조리개를 조정 phototoxicity을 절감하고 표백, 레이저 농도가 낮은 유지하는 역할을합니다.
- 빠른 스캔 모드 ( "포커스 X4")를 사용하여 Z - 깊이 크기를 정의합니다. 신호 강도는 일반적으로 Z - 깊이가 가장 표면에서 가장 낮은 깊이와 끝에 Z - 스택 인수를 시작하는 것이 가장 좋은 방법입니다 함께 감소하기 때문에, 이것은 표백 중요한이 발생하기 전에 더 어려워 신호 취득 수 있습니다.
- 이미지의 깊이에 걸쳐 적절한 신호를 감지 있는지 확인합니다. 원하는 경우, Z - 차원의 밝기 보정 기능 ( "밝은 Z") 특정 깊이에서 이미지 수집 매개 변수를 조정하는 데 사용할 수 있습니다.
- 실험의 필요에 따라 Z - 차원 단계 크기를 설정합니다. 예를 들어, 첫번째 예제 (그림 1)에서 우리는 단순히 때문에 우리가 15 미크론으로 Z - 깊이를 설정하고 망막 당 5-7 이미지를 먹었는데, 연속 일 동안 각각의 망막에있는 '셀 조사'를 복용했다. 이 전략은 우리가 이미지를 사이에 휴대폰 중복 각 망막를 맛볼 수있었습니다. 두 번째 예를 들어 (그림 2)에서, 우리는 공간 상관 할 필요 GFP와 mCherry 신호, 따라서 우리가 세 번 이론적 측면 해상도 Z - 스택 이미지를 허용하는 절충안을 위해 단계 크기를 설정하는 빠른 4D 시간 경과 영화를 수행한 모든 5-10분 데려가지만, 여전히 개별적인 세포 세부 사항을 해결하기 위해 제공하는.
- 영상을 얻은 ( "XYLZt") 및 저장합니다. 직렬 시간 경과 실험 (아래 # 4 참조) 수행하면 다음 물고기에 이동합니다. 빠른 시간 - 경과 영상은 아래 # 5를 참조하십시오.
4. 시리얼 '캐치 및 릴리스'이미징 : 역대 일 동안 개인 피시에서 세포 변화를 추적하는 방법
- '캐치 및 릴리스'프로토콜은 시간이 생선의 양을 최소화하는 데 사용되는 고정하고 실험 당 몇 군데 물고기의 수를 증가합니다. 이 기법의 유용은 (예 : 멈 외. 2006 2) 일 동안 펼쳐 생물 학적 과정으로 제한됩니다. 이 방법의 장점은 어떤 관찰 변화가 내부 통제 수 있습니다 점이다, 개인의 다양한 상태 사이보다는 집단 전체 즉, 비교. 처음 라벨 세포의 수가 각각 물고기 사이에 크게 차이가 경우에도 예를 들어, 레이블 세포의 수가 추적 변화가 주어진 조직에 존재 정확하게 수행할 수 있습니다. prodrug 유도된 세포 절제 분석 3,5의 컨텍스트 내에서이 프로토콜을 사용하기위한 방법은 여기에 제공됩니다.
- 시간이 지남에 따라 각 물고기의 타겟 세포 유형의 절제와 재생을 시각화하기 위해 공촛점 이미지는 즉시 복구 기간 (복구 이미지) 동안 prodrug 제거 (이후 처리)와 다음, prodrug 관리 (사전 처리)하기 전에 찾았습니다.
- 사전 치료 영상 : 물고기가 탑재 이상으로 몇 군데 있습니다. 일단 물고기들은 배아 매체에 공개 (+ prodrug) 및 28.5에서 incubated 아르 몇 군데있다 ° C 사후 치료 이미징 세션까지. 두 팀에서 근무 한 장착 및 물고기를 공개, 다른 영상이 하루에 몇 군데 수있는 물고기의 수를 최대화하기 위해 좋은 방법이 될 것입니다.
- 이미지 후 하나의 접시에있는 모든 물고기 배아 중간 혼자 (- PTU + /)로 tricaine을 포함하고있는 배아 매체를 교체하십시오.
- 물고기를 공개, 물고기 배아 매체에 자유롭게 수레 때까지 애벌레의 양쪽에 아가로 오스를 잘라 부드럽게 멀리 아가로 오스을 괴롭혀 보석상 집게를 사용합니다.
- Prodrug 유도 절제 : 배아 매체 (+ / - PTU)가 포함된 multiwell 접시 잘 개별로 전송 애벌레 + prodrug (예 : 10mM 메트로니다졸, MTZ)를. 정확한 최종 prodrug의 농도를 보장하기 위해 우리는 일반적으로 나누어지는 배아 매체의 정의 볼륨 (+ / - PTU) 각 우물에 prodrug의 2X 농도 (예, 20 ㎜) 포함. 1X로 최종 prodrug 농도를 가지고 - 생선은 다음 배아 매체의 동일한 볼륨 (PTU + /)의 우물에 추가됩니다.
- 타겟 세포 절제를 확인할 수 있습니다 ° C까지 28.5에서 알을 품다.
참고 : 성공적인 절제를 달성하는 데 필요한 Prodrug 처리 regimens 타겟 세포 종류에 따라 다릅니다, prodrug 농도 및 치료 기간은 경험적으로 결정되어야합니다, 높은 농도는 일반적으로 독성, 예를 들어,> 10 MM MTZ의 원인이있다는 점에 유의하십시오. 또한, 조각난 기자 신호 perdurance은 공촛점 현미경은 충분히 셀 손실을 시각화하는 데 필요한 일부 경우에 절제 성공의 평가를 복잡하게하실 수 있습니다. - 포스트 - 치료 영상 : 물고기가 같은 조직이 최적 지향 이상으로 몇 군데는 그러한 탑재하고 있습니다. 주어진 접시에 모든 물고기가 몇 군데있다되면 그들은 배아 매체 (+ / - PTU)에 출시되는 개별 웰스 (위)로하고 28.5에 incubated ° C ablated 세포 유형의 재생을 허용합니다.
- 복구에 필요한 생선과 시간의 나이에 따라 그것은 분석의이 단계에서 물고기를 공급해야 할 수도 있습니다. 우리는 최적의 생존을 보장하기 위해 이러한 paramecia 또는 rotifers로 사는 음식을 사용합니다. 그것은 물고기가 낮은 볼륨 (예, 96 잘 접시)에 유지 특히 경우, 또한 매일 새로운 미디어를 제공하는 것이 좋습니다.
- 복구 이미지 : 셀 교체의 속도론을 문서화하기 위해이 물고기는 복구 기간 동안 매일 몇 군데하실 수 있습니다. 동력학이 설립되어 일단 분석은 관심의 시간 점 (예를 들어, 전체 복구)에서 복구 이미지를 인수하여 간단하게하실 수 있습니다. 그림 1은 망막 세포 재생 우리의 연구에서이 방법의 예를 제공합니다.
- 실험 물고기의 결론에서 얼음 20X tricaine (15.3 μm의) 용액에 침지하여 euthanized해야합니다.
5. 빠른 시간 저속 영상.
- 여러 fluorphores의 빠른 시간 경과 영상 (즉, '영화')의 경우, phototoxicity 문제를 최소화 기술 (위 참조) 중요합니다. 위에서 언급한 바와 같이,이 기술은 최상의 이미지는 오히려 순차보다 동시 있도록 fluorphores에 적합합니다
- 28.5에서 생선을 유지 ° C 열띤 무대, ITO 유리 가열 요소 또는 유사한를 사용합니다.
- (예, 거꾸로 현미경을위한 O - 링 봉인 coverslips) 온도와 osmolarity 안정화를 도움이 증발을 줄일 방법을 사용합니다.
- 확장 회 이상 자동 수집을 사용하는 경우 Z - 차원의 성장 및 / 또는 표류 수 있도록 스택 크기를 설정해야합니다.
- 시간 간격 및 스캔의 번호를 ( "TimeScan"또는 "TimeController")로 설정합니다. 취득 가격은 몇 군데 및 / 또는 관심의 세포 인구의 phototoxic 감도 특성에 따라 조정 생물 학적 과정의 역학에 따라 경험적으로 확립해야합니다.
- 영상을 얻은 ( "XYLZt"버튼) 및 저장합니다.
- '영화'를 구축, 관심 영역의 X, Y, 그리고 Z 치수에 정의된하고 정렬해야합니다. 전체 과정은이 프로토콜 심사의 범위를 넘어하지만 몇 가지 소프트웨어 프로그램은 또한 4D 이미지를 조립 (Volocity, Amira 등)하는 동안 줌, 회전, 및 패닝 기능을 촉진하는 사용할 수 있습니다.
6. Imagej 프리웨어를 사용하여 스펙트럼 분리 이미지 처리
- 최적 다중 기자 이미징 실험을 수행할 때 그것은 잘 spectrally 구분 fluorphores를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 그러나, 이것은 항상 실용적 및 / 또는 수 없습니다. 여기 우리는이 사건 GFP와 YFP에서 여기 및 방출 프로파일을 중복이 fluorphores 분리를위한 단순화된 방법을 제공합니다. 제공된 예제에서, 우리는 시간 저속 영상 기법 YFP와 NTR - mCherry으로 표시 망막 바이폴라 세포의 대상 절제하고 재생하는 동안, GFP - 라벨이 망막 '줄기 세포'멀러 glia의 행동을 추적하기 위해 위에서 설명한 사용한 (그림 2).
- 순차 이미징 모드 중복 fluorophores은 독립적으로 획득하여 부분적으로 (GFP / YFP 설정 예를 들어, 위 참조) 각각 분리 수 있도록 변수 장벽 필터를 사용하여 이미지를 수집합니다. 누화를 제거하려면 우리는 다른 한 채널의 신호를 제거하는 간단한 이미지 빼기 전략을 사용합니다.
- 이미지 감법 공정 : 설치된리터 ImageJ의 최신 버전 (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html) Loci는 바이오 포맷 도구 (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) 그리고 스택 플러그인 (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html)를 맞춥니다.
- 이미지 파일을 열 수있는 Loci 바이오 형식 가져오기 플러그인을 사용하여, 단순히 ImageJ 창에 관심의 파일을 드래그하면 가져오기 도구를 시작합니다. 로딩 후 "채널 도구"(+ Ctrl + Z를 교대) 아래에있는 "분할 채널"가져오기 창에서 확인란 또는 "분할 채널"탭을 사용하여 개별 스택에 채널을 분할.
- 3 TP 플러그인 (플러그인> 정렬 스택> 정렬 3 TP)를 정렬 시작합니다. 스택은 적절한 뺄셈 수 있도록 정렬해야합니다. 두 번째에서 첫 번째 드롭 다운 상자와 잘못 정렬된 스택에서 참조 스택을 선택합니다. "를 사용하여 XY 상대 기원"과 "을 사용하여 Z 상대 원점"확인란을 선택하고 "확인"을 클릭하십시오.
- 정렬 프로세스를 시작하려면 "볼륨 등록"버튼을 클릭하십시오. 새 창이 정렬 매개 변수를 포함하는 나타납니다. 이 섹션은 플러그인의 유통에 의해 최적화되었습니다, 더 수정이 필요하지 않습니다, 단순히 "확인"을 클릭합니다.
- 완료되면, "연합 스택스"창이 나타납니다. 정렬 창에서 "출력"을 선택하고 출력 창에 나타납니다. 이 창문은 또한 최적화와 아무런 수정을 필요로하지 않습니다. "확인"을 클릭하십시오. 새로운 스택은 파일 제목의 끝에 추가 "연합"을 작업 공간에 나타납니다.
- 누화는 "이미지 계산기"(공정> 이미지 계산기)를 사용하여 제거됩니다. Image2 드롭 다운 상자에서 빼기에 사용되는 Image1 드롭 다운 상자와 스택에서 빼서 수 스택을 선택합니다. 작업 드롭 다운 상자에서 "빼기"를 선택하고 "확인"을 클릭합니다. ImageJ는 "예"를 선택, 스택을 처리 요청합니다. 새로운 스택은 중복 채널 간의 누화를 제거 가지고있는가 나타납니다.
- 정렬과 뺄셈 스택은 병합해야하기 전에 동일한 이미지 구조를 재현하려면 다음과 같이하십시오. 채널 도구 창에서 "병합 채널"를 선택하십시오. 도구 hyperstack로 4 스택까지 합류하실 수 있습니다.
참고 : 연결할 도구 (이미지> 스택> 도구> 연결하여)를 사용하여 원하는 순서대로 4 개 이상의 스택 연결할 스택을 병합합니다. hyperstack (hyperstack에 이미지> hyperstack> 스택)에 연결된 스택을 변환합니다. 스택의 연결은 깊이, 시간, 채널 (zct) 주문이 나타나는 드롭 다운 상자 내에서 재설정해야 변경, "채널"을 설정, xyztc에 "주문을"설정 "조각"와 "프레임"에 따라 각각 스택, 스택의 깊이, 시간과 포인트의 번호, 숫자 .. - 마지막으로, 모든 채널은 colorized 밝기 및 대비를위한 조정 및 TIFF 파일로 저장해야합니다. 여기에서, RGB, 몽타주, Z - 프로젝션, 또는 시계열로 변환은 원본 파일과 동일한 과정입니다.
7. 대표 결과
그림 1. 망막 바이폴라 세포를 (적색 셀) 표현 NTR - mCherry 타겟팅 상실과 재생을 보여주 공촛점 이미지의 시간 저속 시리즈. 치료 & A ') 전에 노란색으로 표시된 "조정"양극 세포, 그리고 빨간색으로 표시된 "대상"bipolars에 nitroreductase - 체리 융합 단백질의 막 - 태그 YFP 기자의 모자이크 표현이 있습니다. 메트로니다졸, 붉은 nitroreductase - 표현의 노란색 "조정"양극성 세포가, 목숨이 붙어있는 동안 바이폴라 세포를, 손실됩니다.과 B & B ')에 따라 치료 이것이 절제 방법론의 높은 특성을 보여줍니다. C & C ') 메트로니다졸 제거, NTR - 표현 (적색) 셀을 반환합니다.
그림 2. GFP와 YFP가 깨끗하게 다음과 같은 인수를 분리 수 있습니다 이미지를 빼기 프로세스의 예제를 제공합니다. A & 이전 뺄셈, GFP (녹색) 및 YFP (pseudocolored 보라색) 이미지로 ')이 정렬됩니다. B & B ') 뺄셈 프로세스는 GFP - 표시 멀러 glia이보다 쉽게 감지 수 있도록, YFP - 표시 바이폴라 세포가 GFP 이미지에서 제거할 수 있습니다. 세포가 화살표로 표시에서 C & C ') GFP (녹색) 및 mCherry (적색)의 공동 표현은 분명하다. 멀러 glia 세포 마커 및 바이폴라 세포 마커의 공동 표현이 암시 때문에 바이폴라 세포 절제가 손실된 세포를 대체 멀러 glia을 트리거합니다. 이 해석은 포유 동물과 물고기를 모두 부상 유발 '줄기 세포'와 같은 뮐러의 glia를 연루 망막 중생의 최근 연구를 유지하고 있습니다.
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 사용 기술의 개요가 제공됩니다. 타겟 세포 절제가 신경 회로 기능과 세포 고유의 연결을 재생 패러다임을 연구하는 데 사용하는 동안 우리는 생체내에 대한 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 시간 저속 영상을 사용합니다. 예제는 이러한 방식에서 gleaned 수있는 몇 가지 장점을 강조 표시됩니다. 아마도 가장 중요한 시간 경과 영상은 내부 통제 패러다임을 제공 관찰 모든 현상은 이전 상태로 다시 관련되어 있습니다. 이것은 직접보다는 유추 비교가 수치 쉽게 상대적인 변화를 만들고 인구 내에서 변화와 관련된 실험 '소음'을 감소 실험 시간이 지점에 걸쳐 만들 수 있습니다. 여러 가지 빛깔의 이미지의 장점은 상호 작용 및 / 또는 인접 세포 유형의 변화를 시각화하는 능력입니다. 예를 들어, 멀러 glia를 라벨 유전자 변형 라인을 사용하여, 우리는 이제 개별 망막 세포 subpopulations의 손실이 잠재적인 부상을 유발 줄기 세포의 반응을 특성화하고 있습니다. 우리는 또한 신경 회로 형성 2 소설 메커니즘을 정의하기 위해이 방법을 사용했습니다. 마지막으로, 세포 재생 연구 이외에, 우리는 최근의 연결 subtypes의 기능 역할을 다양한 행동 패러다임과 electrophysiological assays을 사용하므로 개별 신경 회로를 조사하기 위해 NTR 기반 절제 시스템을 사용하기 시작했습니다. 이러한 연구 zebrafish을 고용의 독특한 장점은 자신의 재생 능력으로 인해, 유도의 적자가 일시 그입니다. 따라서, 시간 저속 영상 assays과 연관하여 우리는 reinnervation의 메커니즘을 초래할뿐만 아니라, 기능 회복에 필요한 reinnervation의 범위를 typify 수 있습니다.
제공 방법은 여러 가지 질문에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 절제와 중생의 유사한 분석은 어떤 transgenically 정의 셀룰러 subtype에 적용할 수 있습니다. 이하 이러한 연구가 개별 세포 유형의 수준과 이산 줄기 세포 틈새 내에서 재생에 대한 우리의 이해를 확장 가능성이있다.
Disclosures
JSM은 zebrafish의 세포 절제의 nitroreductase 기반 시스템 (멈 JS, 그리고 Schroeter, Zebrafish "미국 특허 7,514,595에서 EH 타겟 지역 박리 세포 절제. 2009년 4월 7일)의 사용에 대한 특허를 획득했습니다.이 기법은 도구 및 JSM은 설립과 서비스를 생명 공학 회사, Luminomics 주식 회사에 대한 일반적인 플랫폼으로 사용하는 것은 인치 이해 관계자 남아
Acknowledgments
우리는 DRS 감사하고 싶습니다. 미라 Saxena 및 원고에 도움이 덧글에 대한 조나단 마타. 우리는 DRS 감사합니다. 형질 라인을 제공하는 마이클 파슨스, 파멜라 레이먼, 그리고 레이첼 웡. 동물 실험 프로토콜 07-12-003을 승인 MCG IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었습니다 * B. 이 작품은 JSM에 NIH R21 MH083614과 천 바실 O 코너 초보 학술 상을 월 지원했습니다
Materials
1. Reagents: |
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Danieau's solution: |
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Other reagents: |
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2. Supplies: |
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3. Equipment: |
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References
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