Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Summary

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di interesse

Abstract

Ad alta risoluzione time-lapse imaging di larve di zebrafish vivente può essere utilizzato per visualizzare come i processi biologici si svolgono (per una rassegna vedi ^1). Pesce composto transgenici che esprimono diversi reporter fluorescente in tipi di cellule vicine fornire un mezzo di seguire interazioni cellulari ² e / o tessuto risposte a livello di manipolazioni sperimentali nel corso del tempo. In questo video, dimostriamo metodi che possono essere utilizzati per l'imaging più tipi di cellule transgenically etichettati serialmente nel pesce singoli corsi nel tempo che può estendersi da pochi minuti a diversi giorni. Le tecniche descritte sono applicabili a qualsiasi studio cercando di correlare il "comportamento" della vicina tipi di cellule nel tempo, tra cui: 'catch and release' 1) seriale metodi per l'imaging di un gran numero di pesci più giorni consecutivi, 2) metodi semplificati per la separazione fluorofori con sovrapposizione di eccitazione / emissione di profili (ad esempio, GFP e YFP), 3) uso di ipopigmentate linee mutanti di estendere la finestra temporale a disposizione per imaging ad alta risoluzione in ritardo stadi larvali di sviluppo, 4) uso di membrane mirato reporter fluorescente per rivelare multa dettaglio morfologico delle singole cellule così come i dettagli cellulari in grandi popolazioni di cellule, e 5) un metodo precedentemente descritto per chimicamente indotte ablazione di tipi di cellule transgenically mirata, cioè, nitroreductase (NTR) conversione mediata di substrati profarmaco, come il metronidazolo (MTZ), ai derivati ​​citotossici ^3,5.

Come esempio di questi approcci, si visualizzerà l'ablazione e la rigenerazione di un sottotipo di retina bipolare neurone all'interno di singoli pesci più giorni. Contemporaneamente ci sarà monitorare diversi altri tipi di cellule della retina, compreso vicini e non mirato le cellule bipolari e il potenziale degenerazione stimolate le cellule staminali della retina (ad esempio, glia Mϋller). Questa strategia viene applicata nel nostro laboratorio per la caratterizzazione delle cellule e dei tessuti a livello (ad esempio, di nicchia delle cellule staminali) risposte alla perdita selettiva e la rigenerazione di mirati tipi di cellule neuronali.

Protocol

1. Le linee transgeniche e Mutant

1. Definire / acquisire linee zebrafish transgenico che sono tipi di cellule di interesse differenziato etichettati con varianti giornalista fluorescenti. In modo ottimale, l'eccitazione / emissione profilo del reporter selezionato deve avere sovrapposizione minima (ad esempio, ECFP e EYFP), tuttavia questo non è assolutamente necessaria. Per i nostri scopi, l'uso di membrane legato reporter fluorescente facilita notevolmente l'imaging di fini dettagli cellulari, come i processi neuritiche, per risolvere numero di cellule individuali e / o morfologie in grandi gruppi comingled e di 'evidenziare' le regioni del contenuto membrana elevata, come neuropils sinaptica.
2. Per l'imaging a tarda stadi larvali, è utile per derivare / cross linee transgeniche in background mutante che riducono la pigmentazione [ad esempio, Roy Orbison (roy) o Roy Orbison; albino (Roy; alb), ^4]. Nella nostra esperienza, la riduzione della iridiphores (ad esempio, Roy) è la questione più critica, melanogenesi può essere affrontato chimicamente con 1-2-fenil thiourea (PTU) o con "albino" mutanti che mancano melanofore. Si noti comunque che Ren et al. ^4, hanno dimostrato deficit visivo e modesti cambiamenti morfologici in retine di pesci privi melanaphores, e che la luce intensa può indurre la morte dei fotorecettori in "albino" mutanti. Quindi, queste questioni devono essere presi in considerazione quando si progetta esperimenti di imaging e / o l'interpretazione dei dati.
3. Per questa dimostrazione, le linee di pesci transgenici e mutanti utilizzati sono stati:
   1. Tg (Nyx: GAL4-VP16) ^{q16a / +;} Tg (UAS: gap43-YFP) ^{q16b / +;} Tg (UAS-E1b: NfsB-mCherry) ^{C264 / +;} Tg (PAX6-DF4: gap43-PCP) ^{Q01 / +;} roy ^a9/a9
   3. Nota: Nel pesce "1", una sottopopolazione di Nyx-promotore definite cellule bipolari della retina esprimere una membrana-tagged YFP e / o un NTR-mCherry reporter di fusione (più esprimere sia), e quasi tutte le cellule retiniche esprimere una membrana-tagged PCP . Pesce "2" sono come sopra, tranne le cellule gliali Müller esprimere la GFP citosolica e globale espressione CFP della retina è stato eliminato. Espressione del NTR-mCherry fusione rende nyx definite cellule bipolari suscettibili di profarmaco indotta ablazione ^3,5.

2. Selezione e preparazione embrioni / larve per dell'immagine in tempo reale

1. Mate transgenici / linee mutanti di interesse, raccogliere le uova e incubare / mantenere a 28,5 ° C in soluzione 0.3X Danieau (o di 'medium embrione' di scelta).
2. Se non in uno sfondo "albino", PTU deve essere aggiunto per inibire l'attività della tirosinasi prima di qualsiasi prova di pigmentazione nel tessuto di interesse (ad esempio, ~ 16 HPF per l'occhio, 200 mM finale). Si noti che il trattamento con PTU a concentrazioni superiori a 75 mM può causare tossicità e / o effetti teratogeni. Tuttavia, poiché l'occhio è fortemente pigmentata, trattamenti al di sotto 200 micron non sono adeguati per imaging ad alta risoluzione confocale, in queste condizioni, è importante scegliere pesci sani alla ricerca di immagini. Per i tessuti imaging, 75 mM PTU può essere preferibile. Inoltre, come notato sopra, l'utilizzo di "albino" linee mutanti evita la necessità di trattare gli embrioni con PTU ed è una strategia migliore per ottenere immagini a tarda stadi larvali.
3. Una volta che i giornalisti fluorescenti sono evidenti, specie di pesce secondo l'espressione del transgene e la salute generale utilizzando un microscopio a fluorescenza zoom stereo o simili.
4. Prima del primo giorno di imaging, si dissolvono bassa temperatura di fusione agarosio (LMA) in un mezzo embrione ad una concentrazione finale del 0,5%, il calore e mescolare per entrare in soluzione, conservare a 40 ° C.
5. Il primo giorno di imaging, preparare la soluzione di montaggio: Aggiungi tricaine (un anestetico, 756 mM finale) e PTU (se necessario) al 0,5% in media LMA embrione, mescolare delicatamente e ritorno a 40 ° C.
6. Anestetizzare i pesci con il trasferimento in media embrione contenente PTU e / o tricaine, dare il tempo per i pesci a non rispondere al tatto (~ 3 min).
7. Trasferimento singoli pesci in soluzione di montaggio, avendo cura di non diluire il agarosio in modo che possa essere riutilizzato. Usiamo una micropipetta con punta tagliata per il trasferimento, questo aiuta anche a mantenere un volume controllato (~ 30 mL). Dopo aver acquisito, invertire pipetta e lasciare che i pesci depositano sul fondo in modo da toccare la punta alla soluzione di montaggio consente il trasferimento gravità senza bisogno di dissipare ogni liquido.
8. Dopo il trasferimento, espellere soluzione anestetica da micropipetta e utilizzarlo per trasferire il pesce in una goccia ~ 30 ml di soluzione di montaggio di una piastra di Petri.
   Nota: Questo metodo di montaggio è rilevante solo per la microscopia in posizione verticale in cui lunga distanza di lavoro obiettivi immersione in acqua verrà utilizzata. Per methods rilevanti per microscopi invertiti, dove sono richieste coprioggetto, vedere Andersen et al, 2010;. O'Brien et al, 2009;. Graeden e Sive, 2009.
9. Ritorna soluzione di montaggio a 40 ° C il riscaldamento blocco.
10. Utilizzando un pennello ciglia o simili ruotare delicatamente pesce in l'orientamento desiderato e la posizione della regione di interesse nel centro della goccia di agarosio.
11. Ripetere i passaggi 6 a 10 per montare il numero desiderato di embrioni per ogni piatto. Per la serie time-lapse esperimenti (vedi sotto) che tipicamente montare sei pesci alla volta e cercare di limitare le sessioni di imaging a 1 ora per gruppo.
12. Durante il montaggio altri pesci controllare per assicurarsi che i soggetti precedenti mantenere orientamento desiderato fino agarosio solidifica (~ 3 min).
13. Dopo agarosio si è solidificato, il trasporto di pesce di mettere in scena microscopio confocale e delicatamente aggiungere medio embrione contenente PTU e / o tricaine per il piatto fino a quando tutti i pesci sono completamente sommerse.

3. "Multicolor" in vivo confocale Imaging

Nota: Abbiamo cercato di generalizzare il protocollo di sotto di tale che essa fornisce le informazioni rilevanti per le configurazioni microscopio altri. Riferimenti specifici alla Olympus e applicazioni software ImageJ sono tra virgolette. Il nostro è un sistema di imaging Olympus FV1000 microscopio confocale verticale dotata di 405, 440, 488, 515, 559, Laser e 635 nm, due canali di rilevazione variabile barriera filtrante (che permette le impostazioni di lunghezza d'onda di emissione regolabile in incrementi di 1 nm), una barriera standard filtro di canale (per il rosso e rosso lontano imaging), e un canale di luce trasmessa.

1. Aprire il software di imaging ("FV10-ASW") e utilizzare fonti di luce o trasmessi o fluorescente per individuare la regione di interesse. Per l'imaging ottimale di cellulare e / o molecolari utilizzare dettaglio gli obiettivi a lunga distanza di lavoro ad alta NA (ad esempio, 60X, 1.2NA).
2. Se la raccolta delle foto a luce trasmessa, messa a fuoco il diaframma di campo per l'illuminazione di Kohler.
3. Scegli fluorphores appropriata dal "Lista Dye" o caricare i parametri di acquisizione da un file immagine precedentemente salvata. Apportare modifiche alle gamme di emissione ("Impostazione spettrale") necessari per la netta separazione dei segnali di giornalista e / o segnale di massima ai rapporti rumore. Queste impostazioni devono essere definite empiricamente per ogni esperimento di minimizzare il crosstalk, ma massimizzare il segnale, le impostazioni per gli esempi forniti qui sono riportati di seguito:

   Flourphores	Laser (nm)	Impostazioni barriera / filtro di emissione (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
   2) EGFP **, ** EYFP, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   Imaging * di mCherry potrebbe essere migliorata utilizzando un laser lunghezza d'onda superiore (ad esempio, 568 o 594 nm)
   ** Una modalità di imaging sequenziale consentendo dicroico cambiamenti specchio e filtro barriera ("canali virtuali") è necessaria a causa di emissione / eccitazione sovrapposizione tra GFP e YFP. GFP e mCherry possono essere assegnati a un canale, YFP ad un canale separato. Nota: crosstalk tra GFP e le immagini YFP saranno evidenti prima di sottrazione delle immagini (parte 6).
4. Assicurarsi che l'obiettivo utilizzato è selezionato nel menu a tendina, assicurarsi che ogni software sono regolati preset definiti correttamente.
5. Per mettere a fuoco laser e livelli di potenza impostata, selezionare un look up table (LUT) che rivela la saturazione dei pixel ("Hi-lo") per ogni canale. Rivelatore sensibilità impostata ("HV", tensione PMT) ad un valore coerente con la qualità dell'immagine desiderata (definito empiricamente) e gradualmente aumentare la produzione fino a quando l'intensità laser immagine è accettabile evitare la saturazione dei pixel.
6. Verificare la presenza di crosstalk tra i canali, in modo che ogni linea laser produce segnale rilevabile solo nel canale appropriato girando manualmente laser e disattivare durante il monitoraggio di tutti i canali di imaging. Per eliminare le interferenze ridurre la potenza del laser. Se non diafonia è evidente, tutti i canali possono essere acquisite simultaneamente fornendo significativi risparmi di tempo.
7. In caso di crosstalk inevitabile, utilizzare una modalità "sequenziale" di imaging che permette di passare i laser / canali singolarmente. Casi estremi (ad esempio, l'imaging GFP e YFP) richiedono l'uso di modalità sequenziale che anche passare specchi dicroici e / o filtri barriera ("canali virtuali"). Nota: questa opzione introduce significativi ritardi temporali nel processo di acquisizione delle immagini e non possono essere apvalicano i catturare processi altamente dinamici.
8. "Zoom" e "Rotazione" funzioni possono essere utilizzate per inquadrare ulteriormente l'area di interesse. Zoom può essere utilizzato anche per migliorare la risoluzione dell'immagine, fino ai limiti del formato obiettivo e scansione utilizzati (ad esempio, 512 x 512; per informazioni su questi temi si veda, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf).
9. Per imaging in vivo in generale e di particolare importanza per time-lapse imaging, le tecniche che minimizzano i problemi di fototossicità (cioè l'accumulo di radicali liberi) hanno bisogno di essere sottolineato, velocità di scansione veloce (ad esempio, 2 ms / pixel) e di uscita del laser a bassa livelli (ad esempio, 1%) deve essere utilizzato quando possibile, così come il formato più bassa risoluzione di scansione per l'acquisizione di adeguate informazioni salienti.
10. Per migliorare la risoluzione delle immagini, la scansione media ("Kalman") può essere utilizzato durante l'acquisizione. Velocità di scansione più lenta ma anche migliorare la risoluzione laser aumentare il tempo di sosta, che aggraverà i problemi fototossicità e sbiancamento. Da notare che entrambi questi approcci non sono l'ideale per time-lapse a causa di potenziale incapacità di cogliere i rapidi cambiamenti attraverso una serie Z, un fenomeno che chiamiamo "blur tempo". Si noti che la media per linea rispetto per fotogramma può aiutare a eliminare i "tempi blur" problemi all'interno di un unico piano, ma non tra z-profondità.
11. Se l'intensità del segnale è basso e la risoluzione massima dell'immagine non è necessario (ad esempio, semplicemente contando il numero di cellule), aumentando l'apertura confocale (diametro del foro stenopeico) può essere utilizzato per aumentare il segnale. Questo serve a mantenere laser a bassa intensità, riducendo la fototossicità e sbiancante, ma regolando l'apertura ad un valore maggiore di 1 unità arioso porta a perdite rapide in termini di qualità dell'immagine.
12. Definire z-depth dimensioni utilizzando una modalità di scansione rapida ("Focus x4"). A causa dell'intensità del segnale generalmente diminuisce con la profondità Z è meglio iniziare a Z-Stack acquisizioni al minor profondità e terminare al più superficiale, questo permette di segnali più difficile da acquisire prima di significativo si verifica lo sbiancamento.
13. Controllo per il rilevamento del segnale adeguata in tutta la profondità dell'immagine. Se lo si desidera, un z-dimensione funzione di correzione della luminosità ("Luminosa Z") può essere utilizzato per regolare i parametri di acquisizione delle immagini a profondità specificata.
14. Impostare la dimensione z-passo a seconda delle esigenze sperimentali. Per esempio, nel nostro primo esempio (Figura 1) siamo stati semplicemente prendendo un 'censimento delle cellule' in retine individuali nei giorni successivi, così abbiamo impostato il z-depth a 15 micron e ha preso 5-7 immagini al retina. Questa strategia ci ha permesso di campionare ciascuna retina senza sovrapposizioni cellulare tra le immagini. Nel nostro secondo esempio (figura 2), abbiamo effettuato un rapido time-lapse 4D film in cui i segnali GFP e mCherry bisogno di essere spazialmente correlata, così abbiamo impostato la dimensione del passo a tre volte la risoluzione teorica laterale di un compromesso che ha permesso z-stack di immagini da prendere ogni 5-10 minuti, ma ancora servito a risolvere i singoli dettagli cellulari.
15. Acquisire immagini ("XYLZt") e salvare. Passare al pesce successivo se l'esecuzione di un serial time-lapse esperimento (vedi punto 4). Per un rapido time-lapse imaging vedi # 5.

4. 'Catch and Release' seriale Imaging: un metodo per Rilevamento delle modifiche ai cellulari a Fish individuali Nei giorni successivi

1. A 'catch and release' protocollo è utilizzato per ridurre al minimo la quantità di pesci tempo sono immobilizzati e per aumentare il numero di pesci ripreso per esperimento. L'utilità di questa tecnica è limitato ai processi biologici che si svolgono su più giorni (ad esempio, Mumm et al. 2006 ^2). Un vantaggio di questo approccio è che permette a qualsiasi cambiamenti osservati per essere controllata internamente, cioè, il confronto tra diversi stati di individui, piuttosto che tra le popolazioni. Per esempio, tenere traccia delle modifiche del numero di cellule marcate presenti in un dato tessuto può essere eseguita con precisione anche se il numero di cellule inizialmente etichettati varia notevolmente tra i singoli pesci. Metodi di impiego di questo protocollo nel contesto di un pro-farmaco-indotta test cell ablazione ^3,5 sono disponibili qui.
2. Per visualizzare l'ablazione e la rigenerazione dei tipi di cellule mirati in singoli pesci nel corso del tempo, le immagini confocale sono acquisite prima della somministrazione profarmaco (Pre-trattamento), immediatamente dopo la rimozione profarmaco (post-trattamento) e durante il periodo di recupero (immagini di recupero).
3. Pre-trattamento di immagini: I pesci sono montati e ripreso come sopra. Una volta che i pesci sono stati fotografato vengono rilasciati in media embrione (profarmaco +) e incubate a 28,5 ° C fino a quando il post-trattamento sessione di imaging. Lavorare in squadre di due, uno di montaggio e rilasciando pesce, l'imaging altro è un buon modo per massimizzare il numero di pesci che possono essere esposte al giorno.
4. Dopo l'imaging tutti i pesci in un piatto unico sostituzione del mezzo embrione contenente tricaine con il mezzo da solo embrione (+ / - PTU).
5. Per rilasciare il pesce, utilizzare pinze gioiellieri per tagliare agarosio su entrambi i lati delle larve e poi delicatamente stuzzicare agarosio via fino a che i pesci fluttua liberamente nel medio embrione.
6. Profarmaco indotta ablazione: larve di trasferimento in un individuo e di una piastra pozzetti contenenti terreno embrione (+ / - PTU) + profarmaco (ad esempio metronidazolo 10mM, MTZ). Per garantire una accurata concentrazioni profarmaco finale che tipicamente aliquota un volume definito di media dell'embrione (+ / - PTU) che contiene una concentrazione di 2X profarmaco (ad esempio, 20 mm) in ciascun pozzetto. I pesci sono poi aggiunti ai pozzetti in un volume equivalente di mezzo embrione (+ / - PTU) per portare la concentrazione finale profarmaco a 1X.
7. Incubare a 28,5 ° C fino a quando l'ablazione delle cellule bersaglio può essere verificata.
   Nota: regimi di trattamento Prodrug necessari per raggiungere l'ablazione di successo variano a seconda del tipo di cellula bersaglio; concentrazione profarmaco e durata del trattamento dovranno essere determinati empiricamente, essere consapevoli del fatto che alte concentrazioni causano tossicità generale, ad esempio,> 10 mm MTZ. Inoltre, perdurance di segnali giornalista frammentato può complicare le valutazioni di successo ablazione, in alcuni casi è richiesto microscopia confocale a visualizzare adeguatamente perdita di cellule.
8. Post-trattamento di immagini: I pesci sono fissata in modo che il tessuto stesso è orientato in modo ottimale e ripreso come sopra. Una volta che tutti i pesci su un piatto dato è stato ripreso vengono rilasciati in media embrione (+ / - PTU) nei singoli pozzetti (come sopra) e incubate a 28,5 ° C per consentire la rigenerazione del tipo di cellula ablato.
9. A seconda dell'età del pesce e il tempo necessario per il recupero può essere necessario per nutrire i pesci in questa fase del test. Noi usiamo cibo vivo come parameci e rotiferi per assicurare la sopravvivenza ottimale. E 'inoltre opportuno fornire mezzi freschi ogni giorno, soprattutto se i pesci sono mantenuti in bassi volumi (ad esempio, 96 pozzetti).
10. Recupero di imaging: Per documentare la cinetica di sostituzione cellulare, i pesci possono essere esposte su base giornaliera durante il periodo di recupero. Una volta la cinetica sono stati stabiliti il ​​test può essere semplificata attraverso l'acquisizione di immagini di ripristino solo in momenti di interesse (ad esempio, il pieno recupero). La figura 1 fornisce un esempio di questo approccio da nostri studi di rigenerazione delle cellule della retina.
11. A conclusione del pesce esperimento dovrebbe essere l'eutanasia per immersione in 20X tricaine (15,3 mM) soluzione su ghiaccio.

5. Rapido time-lapse imaging.

1. Per un rapido time-lapse imaging (ovvero, 'film') di fluorphores multipli, le tecniche che minimizzano i problemi di fototossicità sono fondamentali (vedi sopra). Come detto sopra, questa tecnica è più adatta a fluorphores permettendo contemporaneamente, piuttosto che sequenziale, l'imaging
2. Mantenere i pesci a 28.5 ° C con una fase riscaldata, ITO elemento riscaldante in vetro, o simili.
3. Utilizzare metodi che riducono l'evaporazione per contribuire a stabilizzare la temperatura e osmolarità (ad esempio, o-ring lamelle sigillato per microscopi invertiti).
4. Se si utilizza l'acquisizione automatica su tempi più lunghi assicurarsi di impostare la dimensione dello stack per permettere la crescita e / o alla deriva nello z-dimensione.
5. Impostare gli intervalli di tempo e numero di scansioni ("TimeScan" o "TimeController"). Velocità di acquisizione dovrà essere stabilita empiricamente in base alla dinamica del processo biologico ripreso e / o regolato in base alle proprietà fototossiche sensibilità della popolazione di cellule.
6. Acquisire immagini (pulsante "XYLZt") e salvare.
7. Per costruire 'film', aree di interesse dovranno essere definiti e allineati nelle direzioni x, y, z e dimensioni. L'intero processo va oltre lo scopo di questa revisione protocollo ma diversi programmi software che sono disponibili anche facilitare lo zoom, la rotazione e le funzioni di panning durante 4D immagine di montaggio (Volocity, Amira, ecc.)

6. Elaborazione delle immagini spettrali di separazione con ImageJ Gratuito

1. In modo ottimale, durante l'esecuzione di un multi-reporter esperimento di imaging è meglio usare fluorphores che sono ben separati spettralmente. Tuttavia, questo non è sempre pratico e / o possibile. Qui forniamo un metodo semplificato per separare fluorphores che hanno dei profili di eccitazione e di emissione, in questo caso GFP e YFP. Nell'esempio fornito, abbiamo usato il time-lapse tecniche di imaging di cui sopra per tenere traccia del comportamento di GFP-etichettata retina 'cellule staminali', glia Müller, durante l'ablazione mirata e la rigenerazione delle cellule bipolari della retina etichettati con YFP e NTR-mCherry (Figura 2).
2. Raccogliere le immagini utilizzando modalità di imaging sequenziale e filtri barriera variabile che permettono fluorofori sovrapposizione di essere acquisiti in maniera indipendente e in parte separati, rispettivamente (vedi sopra per GFP / YFP esempio le impostazioni). Per rimuovere crosstalk usiamo una semplice strategia di sottrazione delle immagini che rimuove un segnale dei canali da un altro.
3. Sottrazione immagine di processo: Install l'ultima versione di ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Loci bio-Formati strumento (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) , e allineare pile plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Utilizzare il Loci bio-formati di importazione plug-in per aprire i file di immagine, semplicemente trascinando i file di interesse nella finestra di ImageJ inizierà lo strumento di importazione. Dividere i canali in pile individuali utilizzando il "Canali Split" checkbox nella finestra di importazione o la scheda "Channels Split" sotto "Strumenti Channel" (shift + ctrl + z) dopo il caricamento.
5. Avviare il Allinea 3 TP plugin (plugin> Allinea pile> Allinea 3 TP). Le pile devono essere allineati per garantire la corretta sottrazione. Selezionare lo stack di riferimento nella prima casella a discesa e la mis-allineati dello stack nel secondo. Controllare il "origine relativo utilizzo xy" e "uso z relativa origine" box e cliccare su "OK".
6. Per avviare il processo di allineamento, fare clic sulla "Registrazione Volume" pulsante. Una nuova finestra che contiene i parametri di allineamento. Questa sezione è stata ottimizzata dal distributore del plugin, senza modifiche sono necessarie, è sufficiente fare clic su "OK".
7. Al termine, un "Allineati Stacks" finestra apparirà. Selezionare "uscita" dalla finestra Allinea e la finestra di output dovrebbe apparire. Questa finestra è anche ottimizzato e non ha bisogno di modifiche. Fare clic su "OK". Una pila nuova dovrebbe figurare, nello spazio di lavoro con "allineati" aggiunto alla fine del titolo del file.
8. Crosstalk verrà rimosso utilizzando il "Calculator Immagine" (di processo> Calcolatrice immagine). Selezionare la pila da sottrarre nella casella a discesa Image1 e lo stack utilizzato nella sottrazione nella casella Image2 discesa. Selezionare "Sottrarre" nella casella a discesa Operazione e fare clic su "OK". ImageJ chiederà per elaborare la pila, selezionare "Sì". Un nuovo stack dovrebbe apparire che ha rimosso il crosstalk tra i canali sovrapposti.
9. Per ricreare la stessa struttura di immagine prima Stack allineamento e la sottrazione bisogno di essere uniti. Selezionare "Canali unione" nella finestra di Canale Strumenti. Lo strumento vi permetterà di unire fino a quattro pile in un HyperStack.
   Nota: Per unire più di 4 pile, pile concatenare nell'ordine desiderato utilizzando lo strumento di concatenare (immagini> pile> Strumenti> concatenare). Convertire lo stack concatenati ad un HyperStack (immagini> pila HyperStack> per HyperStack). Concatenazione degli stack cambia la profondità, tempo, canale (ZCT) ordine, questo deve essere ripristinato all'interno della casella a discesa che compare, impostare "ordine" di xyztc, impostare "canali", "fette" e "frames", secondo il numero di stack, la profondità dello stack, e il numero dei punti di tempo, rispettivamente ..
10. Infine, tutti i canali devono essere colorati, rettificato per luminosità e contrasto, e salvati come file TIFF. Da qui, la conversione in RGB, montaggio, z-proiezione, o serie temporale è lo stesso processo per i file originali.

7. Rappresentante Risultati

Figura 1. Un time-lapse confocale serie di immagini che dimostrano la perdita mirata e rigenerazione di NTR-mCherry esprimono retina cellule bipolari (globuli rossi). A & A ') Prima del trattamento è espressione mosaico di membrana-tagged giornalista YFP nel "controllo" cellule bipolari, mostrata in giallo e nitroreductase-Cherry proteina di fusione in "mirati" bipolari mostrato in rosso. B & B ') dopo il trattamento con metronidazolo, il rosso nitroreductase che esprimono cellule bipolari, si perdono, mentre il giallo "controllo" cellule bipolari, sono risparmiati. Questo dimostra la natura altamente specifica di questa metodologia di ablazione. C & C ') Quando metronidazolo viene rimosso, NTR che esprimono (rosso), le cellule di ritorno.

Figura 2. Fornito un esempio di processo di sottrazione delle immagini che consente di GFP e YFP essere nettamente separata successiva acquisizione. A & A ') Prima di sottrazione, la GFP (verde) e YFP (pseudocolored viola) le immagini vengono allineate. B & B ') Il processo di sottrazione permette YFP marcate cellule bipolari da rimuovere dall'immagine GFP, permettendo GFP-etichettata glia di Müller essere più facilmente individuati. C & C ') Co-espressione di GFP (verde) e mCherry (rosso) è evidente nella cella indicata dalla freccia. Perché la co-espressione del marcatore delle cellule gliali Müller e marker delle cellule bipolari suggerisce che l'ablazione delle cellule bipolari trigger glia di Müller sostituire le cellule perse. Questa interpretazione è in linea con recenti studi di rigenerazione della retina che implicano glia Müller come 'cellule staminali' ferita-indotta sia in mammiferi e pesci.

Discussion

In questo video, una panoramica delle tecniche che usiamo per multicolore confocale time-lapse imaging e l'ablazione delle cellule bersaglio è fornito. Ci avvaliamo di time-lapse imaging per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di interesse in vivo, mentre l'ablazione delle cellule bersaglio viene utilizzato per studiare la funzione del circuito e delle cellule neuronali specifici paradigmi rigenerazione neuronale. Gli esempi riportati evidenziano diversi vantaggi che possono essere raccolte da questi approcci. Forse più significativa, time-lapse imaging fornisce un paradigma internamente controllata; fenomeni qualsiasi osservati possono essere legati a stati di nuovo precedenti. Questo permette un confronto diretto, piuttosto che dedurre da effettuare attraverso punti di tempo sperimentali, apportando modifiche relativamente facile da quantificare e riducendo sperimentale 'rumore' associata a variazioni all'interno di una popolazione. Un vantaggio di immagine multicolore è la capacità di visualizzare le modifiche ad interagire e / o tipi di cellule vicine. Ad esempio, utilizzando una linea transgenica che le etichette glia Müller, siamo ora che caratterizzano la risposta di questi potenziali lesioni indotte da cellule staminali per la perdita di discreto sottopopolazioni di cellule della retina. Abbiamo anche usato questo metodo per definire nuovi meccanismi di formazione del circuito neurale ^2. Infine, oltre agli studi di rigenerazione cellulare, abbiamo recentemente iniziato a utilizzare il NTR sistema basato ablazione per indagare il ruolo funzionale dei sottotipi neuronali così i circuiti neurali separati utilizzando diversi paradigmi comportamentali e analisi elettrofisiologiche. Il vantaggio unico di impiegare il pesce zebra per tali studi è che, grazie alla loro capacità rigenerativa, i deficit indotti sono temporanee. Così, da correlare con time-lapse analisi di immagini si possono caratterizzare i meccanismi che portano alla reinnervazione, così come il grado di reinnervazione necessari per il recupero funzionale.

Le modalità previste può essere adattato a molte domande differenti. Per esempio, analisi simili di ablazione e di rigenerazione può essere applicato a qualsiasi sottotipo transgenically definibile cellulare. Collettivamente, questi studi hanno un potenziale di espandere la nostra comprensione della rigenerazione a livello di tipi di cellule individuali ed entro nicchie discrete cellule staminali.

Materials

1. Reagents:

Danieau's solution:

sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)

Other reagents:

Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)

2. Supplies:

Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)

3. Equipment:

Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).