Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Summary

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için kullanılır

Abstract

Yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı canlı zebrafish larva görüntüleme biyolojik süreçlerin nasıl (inceleme için bkz ¹⁾ açılmak görselleştirmek için kullanılabilir. Komşu hücre tipleri farklı floresan gazetecilere ifade Bileşik transgenik balık, zamanla deneysel manipülasyonlar hücresel ^{etkileşimleri 2} ve / veya doku düzeyinde yanıtları aşağıdaki bir araç sağlar . Bu video, birkaç gün dakika yayılabilir zamanlı kurslar üzerinden bireysel balık seri görüntüleme birden fazla transgenically etiketli hücre türleri için kullanılabilir yöntemler göstermektedir. Ayırmak için basitleştirilmiş) yaklaşımlar 1) seri yakalama ve bırakma 'görüntüleme yöntemleri, 2 ardışık gün boyunca çok sayıda balık, açıklanan teknikler de dahil olmak üzere, zamanla komşu hücre türleri "davranış" korelasyon isteyen herhangi bir çalışma uygulanabilir: uyarma / emisyon üst üste profiller (örneğin, GFP ve YFP), 3), geliştirme, 4 geç larva etap halinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme için zaman penceresi genişletmek için hipopigmente mutant hatların kullanımı) floresan gazetecilere ortaya hedeflenen membran kullanımı ile fluorophores tek tek hücrelerin yanı sıra hücrelerin büyük popülasyonlarda hücresel bilgi, 5) ve transgenically hedeflenen hücre tipleri kimyasal kaynaklı ablasyon için daha önce açıklanan bir yöntem ince morfolojik detay gibi metronidazol gibi yani, nitroreductase (NTR) prodrogu yüzeylerin aracılı dönüşüm, (MTZ), sitotoksik türevleri ^3,5.

Bu yaklaşımların bir örnek olarak, retina bipolar nöron, birkaç gün içinde bireysel balık içinde bir alt ablasyon ve yenilenme görselleştirmek. Aynı zamanda komşu hedefli olmayan bipolar hücreleri ve dejenerasyon ile uyarılmış potansiyel retina kök hücreleri (yani, Mϋller glia) dahil olmak üzere birçok diğer retinal hücre tipleri, izleyecek. Bu strateji, hedef nöronal hücre tipleri seçici kaybına ve yenilenme için hücre ve doku düzeyinde (örneğin, kök hücre niş) yanıtları karakterize etmek için laboratuarda uygulanmaktadır.

Protocol

1. Transgenik ve Mutant Hatları

1. Hücre tipleri farklı floresan muhabiri türevleri ile etiketlenmiş ilgi transgenik zebrafish hatları oluşturulması / kazanır. Optimal, seçilmiş gazetecilere ikaz / emisyon profili minimal örtüşme olmalıdır (örneğin, ECFP ve EYFP), ancak bu kesinlikle gerekli değil. Bizim amacımız, membran kullanımı büyük ölçüde, büyük comingled gruplar halinde ayrı hücre sayıları ve / veya morfolojileri çözmek için, nöritik süreçleri gibi ince hücresel detayları görüntüleme kolaylaştırır ve floresan gazetecilere gibi yüksek membran içerik bölgeleri, 'vurgulamak' gergin sinaptik neuropils.
2. Geç larva aşamasında görüntüleme için, türetmek / pigmentasyon azaltmak mutant kökenden transgenik hatları çapraz yardımcı olur [örneğin, Roy Orbison (roy) veya Roy Orbison; (alb roy) albino ^4]. Deneyimlerimize göre, iridiphores azaltılması (örneğin, roy) en kritik konu, melanogenesis kimyasal 1-fenil 2-tiyoüre (PTU) veya melanophores eksikliği "albino" mutantlar kullanarak ele alınabilir. Ancak unutmayın Ren ve ark. ^4, görsel açıkları ve balık eksik melanaphores retina mütevazı morfolojik değişiklikler göstermiştir ki, bu yoğun ışık "albino" mutant fotoreseptör ölüme neden olabilmektedir. Böylece, görüntüleme deney ve / veya verileri yorumlama tasarlarken bu konuların dikkate alınması gerekir.
3. Bu gösteri için kullanılan ve mutant transgenik balık hatları şunlardır:
   1. Tg (nyx: Gal4-VP16) ^{q16a / +;} Tg (UAS: gap43-YFP) ^{q16b / +;} Tg (UAS-E1b: NfsB-mCherry) ^{c264 / +;} Tg (pax6 DF4: gap43-CFP) ^{Q01 / +;} roy ^a9/a9
   3. Not: balık "1", nyx-organizatörü ICSI'nin tanımlanan retina bipolar hücreleri (en açık hem) bir zar etiketli YFP ve / veya NTR-mCherry füzyon muhabir ifade ve neredeyse tüm retinal hücreler bir zar etiketli CFP ifade . Müller glia hücrelerinde sitozolik GFP ifade ve küresel retina CFP ifade ortadan kalkmıştır dışında Balık "2" yukarıdaki gibi. NTR-mCherry füzyon İfade prodrogu indüklenen ablasyon ^3,5 duyarlı nyx tanımlanmış bipolar hücreleri vermektedir.

2. Canlı Görüntüleme Embriyolar / larvaları Seçme ve hazırlanması

1. Mate transgenik / ilgi mutant hatları, 28.5 yumurta toplama ve inkübe / bakımını ° C (ya da tercih edilen embriyo orta ') 0.3X Danieau çözümü.
2. "Albino" arka planda değil, PTU ilgi doku (örneğin, göz için ~ 16 hpf 200 mcM nihai) pigmentasyon herhangi bir kanıt önce tirozinaz aktivitesini inhibe eklenmelidir. 75 mcM aşan konsantrasyonlarda PTU ile tedavi toksisite ve / veya teratojenik etkilere neden olabileceğini unutmayın. Gözü yüksek pigmentli Ancak, 200 mcM altında tedavi, yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için yeterli değildir, bu koşullar altında görüntüleme için sağlıklı görünen balık seçmek için önemlidir. Görüntüleme diğer dokular için, 75 mcM PTU tercih edilebilir. Ayrıca, yukarıda belirtildiği gibi, PTU embriyo tedavi ihtiyacı ortadan kaldırır ve geç larva aşamasında görüntüleme için tercih edilen bir stratejidir "albino" mutant hatların kullanımı.
3. Bir kez floresan gazetecilere floresan stereo zoom mikroskop ya da benzeri kullanarak ifade ve genel sağlık transgen göre belirgin, çeşit balık.
4. Görüntüleme ilk gün önce, 40 yaşında bir çözüm, mağaza içine almak için son konsantrasyonu 0.5%, ısı ve karışımı bir embriyonun orta ve düşük erime agaroz (LMA) çözülür ° C
5. Görüntüleme ilk gününde, montaj çözümü hazırlar: embriyo orta ve% 0.5 LMA ekle tricaine (anestezi, 756 mcM Son) ve PTU (gerekirse), hafifçe karıştırın ve 40 ° C dönmek
6. PTU ve / veya tricaine içeren embriyo ortama aktararak balık anestezisi, balık zamanı (~ 3 dk) dokunmaya duyarlı olmaya izin verir.
7. Böylece yeniden agaroz sulandırmak için bakımı, montaj çözümü, bireysel balık aktarın. Biz transferi için kesilmiş ucu ile bir mikropipet kullanır; bu da kontrollü bir hacim (~ 30 mcL) korumaya yardımcı olur. Pipet, invert edinme ve balık montaj çözümü ucu dokunmadan, herhangi bir sıvı dağıtmaya gerek kalmadan yerçekimi transfer sağlar, böylece alt yerleşmek izin sonra.
8. Aktarımdan sonra, mikropipet anestezik çözüm kovmak ve Petri çanak montaj çözümü ~ 30 mcL damlacık balık transferi için kullanabilirsiniz.
   Not: Bu montaj yöntemi daha uzun çalışma mesafesi suya daldırma hedefleri olacak dik mikroskopi için de uygundur. Benim içinlamelleri gerekli olan ters mikroskoplar, ilgili thods, Andersen ve ark, 2010; O'Brien ve ark, 2009; 2009 Graeden ve sive.
9. 40 ° C ısıtma bloğu montaj çözümü dönün.
10. Bir kirpik fırçası ya da benzeri kullanarak istenilen açıda ve pozisyon agaroz damlacık merkezi ilgi bölge içine yavaşça balık döndürün.
11. Istenilen sayıda çanak ortalama embriyoların monte 6 ila 10 adımları tekrarlayın. Seri time-lapse deneyler için (aşağıya bakın) genellikle bir defada altı balık montaj ve grup başına 1 saat görüntüleme oturumları sınırlamak için deneyin.
12. Montaj diğer balık önceki konularda agaroz katılaşır (~ 3 dk) kadar istenilen açıda korumak emin olmak için tekrar kontrol ederken.
13. Agaroz katılaşmış sonra, konfokal mikroskop aşamasında balık taşımacılığı ve tüm balık tamamen batık kadar yavaşça çanak PTU ve / veya tricaine içeren embriyo orta ekleyin.

3. In vivo Konfokal Görüntüleme "Multicolor"

Not: Biz diğer mikroskop yapılandırmaları için uygun bilgiler sağladığını altında protokol genelleştirmek için çalıştık. Olympus ve ImageJ yazılım uygulamaları Özgül başvurular, tırnak içinde. Bizim görüntüleme sistemi 405 ile donatılmış Olympus FV1000 dik konfokal mikroskop, 440, 488, 515, 559 ve 635 nm lazerler, iki değişken bariyer filtresi algılama kanalları (dalgaboyuna ayarları 1 nm artışlarla ayarlanabilir izin), bir standart bariyer filtre kanal (kırmızı ve çok kırmızı görüntüleme için) ve bir ışık kanal iletilir.

1. Görüntüleme yazılımı açın ("FV10-ASW") ve ilgi bölgeyi bulmak için, ya iletilen ya da floresan ışık kaynakları kullanın. Hücresel ve / veya moleküler yüksek NA (örneğin, 60X, 1.2NA) ile ayrıntılı kullanımı, uzun çalışma mesafesi hedefleri en iyi görüntüleme için.
2. Iletilen ışık görüntülerin toplanması varsa, Kohler aydınlatma alanında diyafram odaklanır.
3. "Boya Listesi" nden uygun fluorphores seçin veya önceden kaydedilmiş bir görüntü dosyasını satın alma parametreleri yük. Emisyon aralıkları ayarlamalar ("Spektral ayarlama") muhabiri sinyaller ve / veya maksimum sinyal gürültü oranı temiz ayrılması için gerekli olun. Bu ayarlar crosstalk en aza indirmek ancak sinyal en üst düzeye çıkarmak için her bir deney için ampirik olarak tanımlanmış olması gerekir; Burada verilen örnekler için ayarlar aşağıda gösterilmiştir:

   Flourphores	Lazerler (nm)	Bariyer Ayarlar / Emisyon Filtresi (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
   2) EGFP **, EYFP **, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   * Görüntüleme, mCherry yüksek bir dalga boyunda lazer (örneğin, 568 veya 594 nm) kullanarak daha iyi olabilirdi
   ** Dikroik ayna ve bariyer filtresi ("Sanal Kanallar") sağlayan sıralı görüntüleme modunda emisyon / etkinleştirme GFP ve YFP arasındaki örtüşme nedeniyle gereklidir. GFP ve mCherry ayrı bir kanal bir kanal, YFP atanabilir. Not: GFP ve YFP görüntüler arasında crosstalk Resim Çıkarma (6) önce belli olacak.
4. Kullanılan amacı tanımlanan önayarlarını düzgün ayarlanmış herhangi bir yazılım sağlamak için açılır menüden seçili olduğundan emin olun.
5. Lazerler ve güç seviyeleri ayarlamak odaklanmak için, her kanal için ("Hi-lo") piksel doygunluk ortaya tablosu (LUT) bir göz seçin. Set dedektör hassasiyeti ("YG", PMT voltaj), istenen görüntü kalitesi (ampirik tanımlanan) ve görüntü yoğunluğu kabul edilebilir piksel doygunluk önlemek kadar kademeli olarak lazer çıktı yükseltmek ile tutarlı bir değer.
6. Kanallar arasında crosstalk için kontrol edin; her lazer çizgisi, tüm görüntüleme kanalları izlerken elle lazerler açma ve kapatma sadece uygun kanalı saptanabilir sinyal üretir sağlamak. Çapraz lazer gücü azaltmak ortadan kaldırmak için. Hiçbir crosstalk belli ise, tüm kanallar aynı anda önemli ölçüde zaman tasarrufu sağlayarak elde edilebilir.
7. Kaçınılmaz crosstalk durumunda, bireysel lazerler / kanallar arasında geçer "Sıralı" görüntüleme modunda kullanın. Aşırı durumlarda (örneğin, görüntüleme GFP ve YFP) dikroik aynalar ve / veya bariyer filtreleri ("Sanal Kanallar") geçiş sıralı modları kullanılmasını gerektirir. Not: Bu seçenek, görüntü elde etme sürecine önemli temporal gecikmeler tanıtır ve ap olmayabilirson derece dinamik süreçler yakalamak için Polisaj.
8. "Zoom" ve "Rotation" fonksiyonları daha fazla ilgi alanı çerçevesi için kullanılabilir. Zoom da (örneğin, 512 x 512, amacı ve tarama biçimi sınırları, görüntü çözünürlüğü artırmak için kullanılır; bu konular hakkında daha fazla bilgi için görmek, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res pdf).
9. Genel in vivo görüntüleme ve zaman atlamalı görüntüleme için özellikle önemlidir, fototoksisite konularda (örneğin, serbest radikallerin birikmesi) en aza indirmek teknikleri vurguladı gerekir; hızlı tarama hızı (örneğin, 2 μs / piksel) ve düşük lazer çıktı mümkün düzeyleri (örneğin,% 1) göze çarpan bilgi yakalamak için yeterli olduğu gibi düşük çözünürlükte tarama format kullanılmalıdır.
10. Görüntü çözünürlüğü artırmak için satın alma sırasında kullanılan ortalama tarama ("Kalman"). Yavaş tarama hızları da çözünürlüğünü arttırmak, ancak artış lazer fototoksisite ve ağartma sorunları arttıracaktır zaman yaşamak. Bu yaklaşımların her ikisi de z-serisi, biz "zaman bulanıklık" dediğim bir olgu arasında hızlı değişiklikleri yakalamak için potansiyel yetersizlik nedeniyle zaman atlamalı için ideal olmadığını unutmayın. Not hattı ile karşı kare ortalama bir tek düzlem içinde değil z-derinlikleri karşısında, "zaman bulanıklık" sorunları ortadan kaldırmak için yardımcı olabilir.
11. Sinyal intensitesi düşük ve en yüksek görüntü çözünürlüğü konfokal diyafram (iğne deliği çapı) artırarak, (örneğin, sadece hücre sayıları sayma) gerekli değildir sinyalini arttırmak için kullanılabilir. Bu fototoksisite azaltılması ve ağartma, ancak 1 havadar birim daha fazla hızlı görüntü kalitesinde kayıplara yol açan bir değer diyafram ayarı, lazer yoğunlukları düşük tutmak için hizmet vermektedir.
12. Z derinlik boyutlarını hızlı bir tarama modunu kullanarak ("Focus x4") tanımlayın. Z derinlik z yığın en yüzeysel en düşük derinlik ve sonunda satın almalar başlatmak için en iyi sinyal yoğunluğu genellikle azalır Çünkü, bu beyazlatma önemli oluşmadan önce elde edilecek daha zor sinyalleri sağlar.
13. Görüntü derinliği boyunca yeterli sinyal tespiti için kontrol edin. İsterseniz, z boyutu parlaklık düzeltme fonksiyonu ("Parlak Z") belirtilen derinliklerde görüntü elde etme parametrelerini ayarlamak için kullanılabilir.
14. Z boyutu adım boyutu deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlayın. Örneğin, ilk örnekte (Şekil 1) biz sadece böylece biz 15 mikron z derinliğini ayarlamak ve retinanın başına 5-7 görüntü aldı, ardışık gün boyunca bireysel retina 'hücre nüfus sayımı' götürüyorlardı. Bu strateji, görüntüleri arasında bir hücresel örtüşme ile her bir retina örnek bize izin verdi. İkinci örnekte (Şekil 2), mekansal korelasyon gereken GFP ve mCherry sinyalleri, böylece biz üç kez teorik yatay çözünürlük z yığın görüntüler izin verilen bir uzlaşma için adım boyutu olan hızlı 4D zaman atlamalı filmleri gerçekleştirdi her 5-10 dakika ama hala bireysel hücresel ayrıntı çözmek için servis edilir.
15. Görüntüler elde ("XYLZt") ve kaydedin. Zaman atlamalı bir seri deney (aşağıya # 4 bakınız) yerine bir sonraki balık taşıyın. Zaman atlamalı için hızlı görüntüleme aşağıda # 5.

4. Seri 'Catch and Release' Görüntüleme: Ardışık Gün Bireysel Balık hücresel değişiklikleri izleme için bir yöntem

1. A 'yakalamak ve serbest' protokolü zaman balık miktarını en aza indirmek için kullanılır immobilize ve Deneme başına görüntülü balık sayısını artırmak için. Bu tekniğin yararı, (örneğin, Mumm ve ark ²⁰⁰⁶ 2) gün içinde açılmak biyolojik süreçlerin sınırlıdır . Bu yaklaşımın bir avantajı da herhangi bir gözlenen değişiklikler dahili kontrol edilmesi izin verdiğini, bireylerin farklı devletler arasında değil, yani popülasyonlar üzerinden, karşılaştırmalar. Örneğin, başlangıçta işaretli hücrelerin sayısı arasında büyük bireysel balık bile değişir etiketli hücreleri sayısında değişiklik izleme belirli bir doku mevcut doğru yapılabilir. Bu protokol kapsamında bir prodrogu indüklenen hücre ablasyon tahlil ^3,5 kullanmak için Yöntemleri burada verilmektedir.
2. Hedef hücre tiplerinin zamanla bireysel balık ablasyon ve yenilenme görselleştirmek için, konfokal görüntüleri iyileşme dönemi sırasında (Recovery görüntüler) prodrogu kaldırılması (Post-tedavi) ve hemen ardından, ön ilaç idaresi (Pre-tedavi) önce satın alınan.
3. Tedavi öncesi görüntüleme: Balık monte ve yukarıdaki gibi görüntülü. Bir kez balık embriyo orta salınan (+ prodrogu) ve 28.5 inkübe görüntülenmiştir ° C Tedavi sonrası görüntüleme oturumda kadar. Ikişer kişilik ekipler halinde çalışarak, bir montaj ve balık serbest, diğer görüntüleme Hergün görüntülü balık sayısını en üst düzeye çıkarmak için iyi bir yoldur.
4. Görüntüleme sonra tek bir tabak içinde tüm balık tricaine içeren embriyo ortamda tek başına (- PTU + /) ile embriyonun orta değiştirin.
5. Balık serbest bırakmak için, balık embriyo ortamda serbestçe yüzer kadar larvaları her iki tarafta agaroz kesti ve sonra yavaşça uzakta agaroz tease kuyumcular forseps kullanabilir.
6. Prodrogu indüklenen ablasyon: multiwell plaka embriyo orta (+ / - PTU) içeren bir iyi bir birey haline Transferi larvaları + prodrogu (örneğin 10mM metronidazol, MTZ). Doğru son prodrogu konsantrasyonu sağlamak için genellikle embriyo orta kısım tanımlı ses (+ / - PTU) prodrogu 2X konsantrasyon (örneğin, 20 mM) içeren her kuyuya. 1X için nihai prodrogu konsantrasyonu getirmek için - Balık sonra embriyo orta eşit hacmi (PTU + / -) kuyulara eklenir.
7. Hedeflenen hücre ablasyon kontrol edilebilir 28.5 ° C kadar inkübe edin.
   Not: Başarılı ablasyon elde etmek için gerekli ön ilacıdır tedavi rejimleri hedef hücre türüne göre değişir; prodrogu konsantrasyon ve tedavi süresi ampirik olarak tespit edilmesi gerekecektir, yüksek konsantrasyonlarda genel toksisite, örneğin> 10 mM MTZ neden farkında. Buna ek olarak, parçalanmış muhabiri sinyalleri perdurance konfokal mikroskopi yeterli hücre kaybına görselleştirmek için gerekli bazı durumlarda, ablasyon başarısının değerlendirilmesi karmaşık hale getirebilir.
8. Tedavi sonrası görüntüleme: Balık aynı doku yukarıdaki gibi optimal odaklı ve görüntülü olduğu gibi monte edilir. ° C ablasyon hücre tipi rejenerasyon izin verilen bir plaka üzerinde tüm balık görüntülü sonra embriyonun orta (+ / - PTU) yayımlanan bireysel kuyular (yukarıdaki gibi) içine ve 28.5 inkübe.
9. Kurtarma için gerekli olan balık ve yaşına bağlı olarak bu testin bu aşamasında balık yemi için gerekli olabilir. Biz en iyi hayatta kalmasını sağlamak için, paramecia ya da rotifer gibi canlı yem kullanın. Balık, düşük hacimli (örneğin, 96 kuyucuğu) tutulur, özellikle, aynı zamanda günlük taze ortam sağlamak için tavsiye edilir.
10. Kurtarma görüntüleme: hücre değiştirme kinetiği belgelemek için, balık iyileşme döneminde günlük olarak görüntülenebilir. Kinetiği kurulduktan sonra, testin sadece ilgi noktaları (örneğin, tam kurtarma) kurtarma görüntüleri elde basitleştirilmiş olabilir. Şekil 1, retinal hücre yenilenmesini bizim çalışmalarda bu yaklaşımın bir örneğini sunmaktadır.
11. Deney balık bitiminde buz üzerinde 20X tricaine (15.3 mcM) çözümü daldırma ötenazi olmalı.

5. Hızlı Zaman atlamalı Görüntüleme.

1. Birden fazla fluorphores hızlı time-lapse görüntüleme (yani, 'film') için, fototoksisite konularda en aza indirmek teknikleri (bkz. yukarıda) kritik öneme sahiptir. Yukarıda belirtildiği gibi, bu tekniğin en iyi görüntüleme, yerine sıralı, aynı anda izin fluorphores uygundur
2. 28,5 az balık koruyun ° C ısıtılmış bir sahne, İTO cam gözü veya benzer.
3. (Örneğin, o-ring ters mikroskoplar mühürlü lamelleri), sıcaklık ve ozmolarite istikrara yardımcı olmak için buharlaşmayı azaltmak yöntemleri kullanın.
4. Uzun zamanlar boyunca otomatik olarak satın alma kullanıyorsanız z boyutta büyüme ve / veya sürüklenme izin yığın boyutunu ayarlamak için emin olun.
5. Zaman aralıklarında ve tarama sayısı ("TimeScan" veya "TimeController") ayarlayın. Toplama oranları, görüntülü ve / veya ilgi hücre popülasyonunun fototoksik hassasiyet özelliklerini göre ayarlanır biyolojik bir sürecin dinamiklerine göre ampirik kurulacak gerekecektir.
6. Görüntüler elde ("XYLZt" düğmesi) ve kaydedin.
7. 'Film' inşa etmek, ilgi alanları, x, y ve z boyutları tanımlanan ve uyumlu hale getirilmesi gerekecektir. Tam süreci bu protokol gözden kapsamı dışındadır, ancak bazı yazılım programları 4D görüntü montaj (Volocity, Amira, vb.) Sırasında yakınlaştırma, döndürme ve kaydırma fonksiyonları kolaylaştırmak mevcuttur.

6. ImageJ freeware kullanarak Spektral Ayırma Görüntü İşleme

1. Optimal olarak, bir multi-muhabiri görüntüleme deney yaparken de Işıksal ayrılır fluorphores kullanmak en iyisidir. Ancak, bu her zaman pratik ve / veya mümkün değildir. İşte biz, bu durumda, GFP ve YFP, uyarma ve emisyon profilleri örtüşen fluorphores ayırmak için basit bir yöntem sağlar. Verilen örnekte, geçen zaman görüntüleme teknikleri YFP ve NTR-mCherry etiketli retina bipolar hücrelerin hedefli ablasyon ve yenilenme sırasında, GFP-etiketli retina 'kök hücrelerin, Müller glia davranışını izlemek için yukarıda açıklanan kullanılan (Şekil 2).
2. Sıralı görüntüleme modları ve üst üste fluorophores bağımsız olarak elde edilen ve kısmen (GFP / YFP ayarları örneğin yukarıda), sırasıyla ayrılmış izin değişken bariyer filtreleri kullanarak görüntüleri toplayın. Crosstalk kaldırmak için başka bir kanal sinyal kaldıran basit bir görüntü çıkarma stratejisi kullanın.
3. Image Çıkarma Süreci: Install ImageJ en son sürümü (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Loci Bio-Formatları aracı (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) ve yığınları plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html) hizalayın.
4. Resim dosyalarını açmak için Loci Bio-Formatları İthalat plug-in kullanımı; sadece ImageJ pencere üzerine ilgi dosya sürükleyerek ithalat araç başlayacaktır. Yükledikten sonra "Kanal Araçlar" (shift + ctrl + z) altında "Split Channels" ithalat penceresinde onay kutusu veya "Split Channels" sekmesini kullanarak bireysel yığınlarının içine kanalları Böl.
5. 3 TP eklentisi (eklentiler> Hizala yığınları> Hizala 3 TP) Hizala başlayın. Yığınları uygun çıkarma sağlamak için uyumlu hale getirilmesi gerekir. Ikincisi ise ilk açılan ve yanlış hizalanmış yığını referans yığını seçin. "Kullanımı xy göreceli kökeni" ve "z göreceli kökenli" kutularını işaretleyin ve "Tamam" a tıklayın.
6. Hizalama işlemini başlatmak için, "Cilt Registration" düğmesine tıklayın. Hizalama parametreleri içeren yeni bir pencere görünecektir. Bu bölüm, eklenti dağıtıcısı tarafından optimize edilmiştir, hiçbir değişiklik gerekli, sadece "Tamam" a tıklayın.
7. Bittiğinde, "Bağlantısızlar Yığınları" penceresi görünecektir. Hizala pencereden "Çıkış" ı seçin ve Output penceresinde görünmelidir. Bu pencere de optimize edilmiş ve hiçbir değişiklik gerekiyor. "Tamam" a tıklayın. Yeni bir yığın dosya başlığının sonuna eklenen "Bağlantısızlar" ile çalışma alanı içinde görünmelidir.
8. Diyafoni "Görüntü Hesap Makinesi" (İşlem> görüntü Hesaplayıcısı) kullanarak silinecektir. Image2 açılan çıkarma kullanılan image1 açılan ve yığın düşülür yığını seçin. Operasyon açılan "Çıkart" ı seçin ve "Tamam" a tıklayın. ImageJ "Evet" seçeneğini seçin, yığın işleme soracaktır. Yeni bir yığın hangi kanallar arasında üst üste çapraz kaldırdı görünmelidir.
9. Hizalama ve çıkarma Yığınları birleştirilmiş gerekir önce aynı görüntü yapısını yeniden oluşturmak için. Kanal Araçlar penceresinde "Merge Channels" seçeneğini seçin. Araç hyperstack dört yığınları birleştirme sağlayacaktır.
   Not: en fazla 4 yığınları, birleştirmek yığınları, birleştirmek aracı (görüntüleri> yığınları> araçlar> birleştirmek) kullanarak istenen amacıyla birleştirmek için. Bir hyperstack (hyperstack görüntüleri> hyperstack> yığını) Zincirleme yığını dönüştürme. Birleştirme yığınlarının derinlik, zaman, kanal (ZCT) sipariş, bu görünen açılan kutu içinde sıfırlanması gerekir değişiklikler; "kanal", xyztc "düzen", "dilim" ve "kare" göre sırasıyla yığınları, yığın derinliği ve zaman noktalarının sayısı, numara ..
10. Son olarak, tüm kanallar renklendirilen, parlaklık ve kontrast ayarlanır ve TIFF dosyaları olarak kaydedilmiş olması gerekir. Burada, RGB, montaj, z projeksiyon, ya da zaman serisi dönüşüm orijinal dosyalar için aynı süreç.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 konfokal görüntü retina bipolar hücreleri (kırmızı hücreler) ifade NTR-mCherry hedefli kaybı ve yenilenme gösteren hızlandırılmış bir zaman serisi. A & A ') tedavi öncesinde sarı gösterilen "kontrol" Bipolar hücreler, ve kırmızı ile gösterilen "hedef" bipolars nitroreductase Cherry füzyon proteini membran etiketli YFP muhabiri mozaik ifade vardır. Metronidazol, kırmızı nitroreductase ifade sarı "kontrol" bipolar hücreleri, dışarıda ise bipolar hücreler, kaybolur. B & B ') ardından tedavi Bu, bu ablasyon metodoloji son derece özel niteliği göstermektedir. C & C ') metronidazol kaldırılır NTR-ifade (kırmızı) hücreleri dönüş.

Şekil 2 GFP ve YFP temiz aşağıdaki satın alma ayrılacak sağlayan görüntü çıkarma sürecinin bir örnek sağlar. A & çıkarma, GFP (yeşil) ve YFP (yalancı mor) görüntüleri önce A ') hizalanır. B & B ') çıkarma süreci GFP-etiketli Müller glia daha kolay tespit edilmesini sağlayarak, YFP etiketli bipolar hücreleri GFP görüntü kaldırılacak sağlar. Ok ile gösterilen hücre içinde C & C '), GFP (yeşil) ve mCherry (kırmızı) Eş-ifadesi açıktır. Co-Müller glia hücre belirteci ve bipolar hücre belirteci ifade anlaşılacağı Bu nedenle bipolar hücre ablasyon kaybolan hücrelerin yerine Müller glia tetikler. Bu yorum, memeliler ve balık hem de yaralanma indüklenen 'kök hücreleri' olarak Müller glia saklı retina yenilenme son çalışmalar doğrultusunda.

Discussion

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon kullanım teknikleri hakkında genel bir bakış sağlanır. Hedeflenen hücre ablasyon nöral devre fonksiyonu ve hücre-spesifik nöronal rejenerasyon paradigmalar çalışmada kullanılan iken, in vivo ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için zaman atlamalı görüntüleme istihdam. Örnekler, bu yaklaşımların toplanan çeşitli avantajları vurgulamak gösterilir. Belki de en önemlisi, zaman atlamalı görüntüleme dahili kontrollü bir paradigma sağlar; gözlenen herhangi bir ve tüm fenomenlerin önceki durumlarına geri ilgili olabilir. Bu doğrudan yerine daha anlaşılmaktadır karşılaştırmalar ölçmek kolay göreceli değişiklikler yapma ve bir nüfus içinde yapılacak değişiklikler ile ilgili deneysel 'gürültü' azaltarak, deneysel zaman noktaları arasında yapılacaktır sağlar. Çok renkli görüntüleme bir avantajı, etkileşim ve / veya komşu hücre tipleri değişiklik görselleştirmek için yeteneğidir. Örneğin, transgenik satırını kullanarak Müller glia etiketler, biz şimdi bu potansiyel yaralanma kaynaklı kök hücrelerin kaybı ayrık retinal hücre alt yanıt karakterize edilir. Ayrıca, yeni mekanizmalar nöral devre ^oluşumu 2 tanımlamak için bu yaklaşım kullandık . Son olarak, hücresel yenilenme çalışmalarının yanı sıra, son zamanlarda, nöronal alt tiplerinin fonksiyonel rolü, böylece çeşitli davranış paradigmalar ve elektrofizyolojik testlerin kullanarak ayrık nöral devrelerin araştırmak için NTR tabanlı ablasyon sistemi kullanılarak başladı. Rejeneratif kapasitesi nedeniyle uyarılan açıkları, geçici olarak, bu tür çalışmalar için zebrafish istihdam benzersiz bir avantaj. Böylece, zaman atlamalı görüntüleme testleri ile ilişkilendirilerek reinnervation yol mekanizmaların yanı sıra, fonksiyonel iyileşme için gerekli reinnervation ölçüde typify.

Birçok farklı sorulara verilen yöntemler adapte edilebilir. Örneğin, ablasyon ve yenilenme benzer analizler transgenically tanımlanabilir herhangi bir hücresel alt tipine uygulanabilir. Toplu olarak bu tür çalışmalar, tek tek hücre tipleri düzeyinde ve ayrık kök hücre nişler içinde rejenerasyon anlayışımızı genişletmek için potansiyel var.

Materials

1. Reagents:

Danieau's solution:

sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)

Other reagents:

Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)

2. Supplies:

Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)

3. Equipment:

Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).