Summary
L'activité de la décarboxylase inductible lysine est contrôlée par la réaction du substrat L-lysine et la cadavérine produit avec l'acide 2,4,6-trinitrobenzensulfonic pour former des adduits qui ont une solubilité différentielle dans le toluène.
Abstract
Escherichia coli est une bactérie entérique qui est capable de croître sur un large éventail de valeurs de pH (pH 5 - 9) 1 et, incroyablement, est capable de survivre à l'acide extrêmes souligne notamment le passage par l'estomac des mammifères où le pH peut descendre jusqu'à comme un pH de 1 - 2 2. Pour permettre un tel éventail de survie pH acide, E. coli possède quatre différents décarboxylases inductible acide aminé qui décarboxyler leurs acides aminés dans un substrat de manière à protons dépend donc élever le pH interne. Le décarboxylases inclure le glutamique décarboxylases Gada et BDAG 3, le arginine décarboxylase Adia 4, la lysine décarboxylase LdcI 5, 6 et l'ornithine décarboxylase SPEF 7. Toutes ces enzymes utilisent le pyridoxal-5'-phosphate comme un co-facteur 8 et fonctionnent ensemble avec intérieur de la membrane du substrat sous-produits qui éliminent les produits antiporteurs décarboxylation au milieu extérieur, en échange de substrat frais 2. Dans le cas de LdcI, le antiporteur lysine cadavérine est appelé CADB. Récemment, nous avons déterminé la structure cristalline aux rayons X des LdcI à 2,0 Å, et nous avons découvert un petit roman-molécule liée à la guanosine LdcI réponse strictes régulateur de 5'-diphosphate, 3'-diphosphate (ppGpp) 14. La réponse sévères survient lorsque des cellules en croissance exponentielle expérience de privation des éléments nutritifs ou l'un des nombreux autres types de stress 9. En conséquence, les cellules produisent ppGpp qui conduit à une cascade de signalisation aboutissant à l'évolution de la croissance exponentielle de la croissance en phase stationnaire 10. Nous avons démontré que ppGpp est un inhibiteur spécifique de LdcI 14. Nous décrivons ici le dosage lysine décarboxylase, modifié par le dosage développée par Phan et al. 11, que nous avons utilisée pour déterminer l'activité de LdcI et l'effet de pppGpp / ppGpp sur cette activité. La réaction de décarboxylation LdcI supprime le groupe α-carboxy de la L-lysine et produit du dioxyde de carbone et la cadavérine polyamine (1,5-diaminopentane) 5. L-lysine et la cadavérine peuvent réagir avec l'acide 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) à pH élevé pour générer N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadavérine) et N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectivement 11. Le TNP-cadavérine peuvent être séparés du TNP-lysine que l'ancien est soluble dans les solvants organiques tels que le toluène et le second l'est pas (voir figure 1). La gamme linéaire du dosage a été déterminée empiriquement en utilisant purifiée cadavérine.
Protocol
1) Les réactifs et les équipements
- Tout d'abord, préparer les trois solutions suivantes: 1 mL de la solution A qui est composé de 8 mM de L-lysine, 100 mM de sodium 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) à pH 6,5, 0,2 mM de nucléotides, où le nucléotide est soit: guanosine diphosphate (PIB), guanosine triphosphate (GTP), la guanosine 5'-diphosphate, 3'-diphosphate (ppGpp), ou guanosine-5'-triphosphate, 3'-diphosphate (pppGpp), 0,1 mM de pyridoxal 5'-phosphate (PLP), et 1 mM β-mercaptoéthanol / (β-ME). 1 mL de la solution B qui se compose de 100 mM de sodium MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, et 50 LdcI nM. LdcI a été purifié comme décrit dans Snider et al. 6 et Kanjee et al. 14.
1 ml de solution C qui est identique à la solution B, mais ne contient pas LdcI. - Préparer 100 mL de la solution d'arrêt composé de carbonate de sodium 1 M (10,6 g/100 ml) et 50 ul aliquotes dans chaque puits d'une plaque de polystyrène de 96 puits à l'aide d'une pipette multi-canaux. Ajouter 30 uL d'eau à la plaque, puis couvrir. Notez que la somme du volume d'eau ajoutée et le volume de l'échantillon extrait durant la réaction enzymatique doit être égal à 50 pl. Dans ce cas, 20 uL d'échantillon réaction enzymatique sera supprimé.
- Préparer 5 ml de solution de TNBS à 10 mM en diluant 294 uL de 5% (p / v) de bouillon de TNBS avec de l'eau 4706 ul, l'envelopper dans du papier d'aluminium et de garder sur la glace.
- Equilibrer le thermostat Eppendorf Plus à 37 ° C. Le Plus thermostat a 24 puits en 6 colonnes. Voir Figure 2 pour schématique. Étiquette de 1,5 mL tubes Eppendorf indiquant l'identité du nucléotide qui sera testé (un par colonne): GTP (colonne A), le PIB (colonne B), ppGpp (colonne C), pppGpp (colonne D), aucun nucléotide (colonne E ), et des échantillons de protéines (colonne F).
- Boîtes en rack plusieurs de ces 200 conseils uL que chaque rangée de remplacement est omise donne un total de quatre rangées de pointes. Cela est nécessaire pour l'utilisation de la pipette multi-canaux avec le thermostat et heatblock pendant le dosage enzymatique.
- Equilibrer numérique Heatblock (VWR) à 42 ° C.
- Placer une plaque de 96 puits en polypropylène 2,0 ml sur la glace pour refroidir.
2) Dosage LdcI
- Aliquote de 50 ul de la solution A avec le nucléotide appropriées pour 1,5 mL tubes Eppendorf dans chacune des cinq colonnes du thermostat Eppendorf.
- Ajouter 330 ul de la solution B pour trois tubes dans la colonne F et ajouter 330 ul de la solution C (le contrôle sans protéines) sur le tube de finale dans la colonne F.
- Equilibrer les solutions à 37 ° C pendant cinq minutes. Astuce: après 5 minutes, couper les chapeaux des tubes dans le centre du système de chauffage-bloc pour les empêcher d'interférer avec la pipette multicanaux à être utilisés suivant.
- L'utilisation d'un 5-50 uL VWR multi-canal pipette, transférer 50 ul des tubes dans la colonne F dans chacun des tubes dans les colonnes AE. Démarrer le chronomètre dès que le premier tube est mélangé.
- À 2, 4 et 6 minutes enlever 20 uL d'échantillon à l'aide de la pipette multi-canaux et ajouter à la solution d'arrêt.
- Note: les échantillons dans une solution d'arrêt peuvent être couverts dans une pellicule plastique et congelés à -20 ° C pour un traitement ultérieur. Les plaques doivent être décongelés à température ambiante avant réaction avec le TNBS.
3) Réaction TNBS et le développement de couleurs
- Ajouter 50 uL de MM TNBS 10 solution à la solution d'arrêt à l'aide de la pipette multi-canaux et puis incuber à 42 ° C pendant 6 minutes. La solution prend une couleur jaune foncé / orange comme le TNBS réagit avec la lysine et la cadavérine.
- Après 6 minutes, refroidir la plaque sur la glace pour ralentir la réaction.
- Retirer 100 pi d'échantillon en utilisant un VWR 20-200 uL pipette multi-canaux et la place dans la plaque de 2 mL puits profond qui a été refroidi sur la glace. Transfert seau à glace à la hotte.
- Ajouter 500 ul de toluène à chaque puits en utilisant un HandyStep (Marque) pipeteur répéter et 12,5 mL pipette (Plastibrand).
- Essuyer tout excès de toluène en utilisant un Kimwipe et couvrir la plaque avec des bandes de ruban d'emballage. Assurez-vous d'appuyer fermement pour obtenir une bonne étanchéité. Recouvrir la plaque de 96 puits avec un couvercle plat et ensuite agiter vigoureusement pendant 1 minute et 30 secondes.
- Laissez les solutions pour régler pendant 5 minutes. Le TNP-cadavérine est maintenant dans la phase supérieure du toluène, tandis que le TNP-lysine reste soluble dans l'eau (voir figure 1).
- Retirer 200 ul de toluène en utilisant les 20 à 200 uL multi-canal pipette dans une plaque de 96 puits pour la lecture. Remarque: veillez à vérifier que chaque échantillon étant enlevée est claire et n'a pas de la phase aqueuse inférieure. Remarque: l'utilisation des conseils barrière pour éviter d'endommager la pipette multi-canaux par le toluène.
- Lire l'absorbance à 340 nm dans un lecteur de plaque de SpectraMax 340.
- Pour nettoyer la plaque de quartz, rincer le toluène avec de l'eau et placez la plaque de quartz dans un grandplateau en verre dans la hotte. Verser sur 100 mL d'un mélange 7:3 de 70% (v / v) d'acide nitrique: 95% (v / v) d'éthanol et de recouvrir la plaque de quartz avec un plateau en verre secondes. Attention: la réaction est fortement exothermique protection contre l'usure et parfois explosives appropriées et s'assurer que la ceinture hotte est d'abaisser le 6 "niveau Après refroidissement, laver l'acide nitrique à l'eau puis 95% d'éthanol..
Résultats Représentant 4)
1) Cadaverine standard courbe (figure 3)
Le test a été réalisé comme décrit, mais sans aucune L-lysine ou LdcI et des concentrations différentes, au lieu de cadavérine ont été utilisés pour déterminer empiriquement la gamme linéaire du dosage. Le test est linéaire jusqu'à une DO 340 de 0,25, correspondant à ~ 22 nmoles de cadavérine (figure 3).
2) Activité des LdcI (figure 4)
L'activité de LdcI seul a été établi à 153,5 (± 18,1) nmol cadavérine min-1 ug LdcI-1 à pH 6,5. L'activité de LdcI est insensible à la présence de 100 uM GTP ou le PIB, mais est fortement inhibée (> 10 fois), en présence de pppGpp et ppGpp (figure 4).
Figure 1. Schéma de la réaction LdcI. La réaction de décarboxylation de la L-lysine pour générer du CO 2 et la cadavérine est indiqué ainsi que la réaction ultérieure avec le TNBS à pH élevé pour générer N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadavérine) et le N, N '-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine). Basé sur Phan et al.11
Figure 2. Installation du thermostat Eppendorf. La disposition des échantillons dans le thermostat de 24 puits Eppendorf est montré avec la description des étapes de l'essai (indiqués en gras). Les flèches indiquent le transfert de solutions de réaction selon le protocole. Retrait de la solution de réaction à la solution d'arrêt dans la plaque de 96 puits est également indiquée.
Figure 3. Cadaverine standard courbe. Une parcelle de l'absorbance à 340 nm par rapport nmoles de cadavérine est montré. Les barres d'erreur représentent la déviation standard d'au moins trois mesures indépendantes. La ligne de meilleur ajustement est également représenté et a un R2 de 0,996.
Figure 4. Résultats du dosage LdcI. Une parcelle du taux d'activité LdcI (en nmoles cadavérine produite min-1 ug-1 LdcI) est indiqué dans la présence de 100 uM, GTP PIB, pppGpp, ppGpp et en l'absence de nucléotide. Les nucléotides de réponse sévères (p) ppGpp sont capables d'activité significative LdcI inhibant. Les barres d'erreur représentent la déviation standard d'au moins six mesures indépendantes.
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Discussion
Dans le dosage de la lysine décarboxylase, TNBS réagit avec les amines primaires de L-lysine et la cadavérine pour former le TNP-lysine et la cadavérine TNP-adduits (figure 1). En raison de la présence du groupe acide carboxylique sur le TNP-lysine, cet adduit reste soluble dans l'eau tandis que le TNP-cadavérine, manquant le groupe acide carboxylique, est capable de partitionnement dans le toluène 11. Ce type de test peut être utilisé plus largement sur d'autres types d'acides aminés, où la perte d'un groupe acide carboxylique se produit pendant la réaction. Cela se produit lors de la décarboxylation de la L-ornithine par la SPEF ornithine décarboxylase inductible pour former le polyamines putrescine 7 et la décarboxylation de la L-arginine par l'arginine décarboxylase inductible Adia pour former la polyamine agmatine 4.
Le dosage de LdcI décrite ici fournit une méthode relativement rapide pour la détermination de l'activité de la protéine purifiée in vitro. Les principaux avantages de ce test sont les suivants:
i) Utilisation de plusieurs répétitions par expérience améliore la précision de chaque mesure;
ii) Le test peut être effectué sur une large gamme de conditions (pH différents, sel, agent de réduction etc) sans modification du protocole;
iii) Le dosage peut être modifié pour mesurer l'activité in vivo de LdcI en déterminant le montant de cadavérine excrétés pendant la croissance cellulaire.
Les principales limites de ce test sont les suivants:
i) La sensibilité de ces expériences sont limitées par la gamme linéaire de l'absorbance de l'TNP-adduits;
ii) Les étapes de traitement multiples augmentent l'ampleur des erreurs expérimentales;
iii) ne sont pas tous décarboxylases acide aminé se prêtent à ce type de protocole. Par exemple, la décarboxylation de la L-acide glutamique par décarboxylases inductible de l'acide glutamique Gada / BDAG génère γ-amino-butyrique 2, le TNBS adduit qui sera soluble dans l'eau due à la présence de l'acide de la chaîne latérale carboxylique groupe.
L'enquête biochimiques de la réponse au stress acide de E. coli est une extension du domaine de la recherche et va nous permettre de mieux comprendre les bases moléculaires de la réponse au stress chez E. coli et autres γ-protéobactéries qui ont des systèmes similaires de l'acide réponse au stress tels que Salmonella enterica sérovar Typhimurium 12 et Vibrio cholerae 13. La découverte que l'activité LdcI est inhibée par le régulateur de réponse ppGpp strictes nous a fourni un aperçu jusque-là inconnues dans la régulation de cette protéine.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) pour nous envoyer des souches bactériennes, plasmides, et les protocoles nécessaires. Nous remercions le Dr John Glover (Département de biochimie, Université de Toronto) pour l'utilisation du lecteur de plaque SpecraMax. Royaume-Uni est le destinataire d'un en sciences naturelles et en génie du Canada, bourses d'études supérieures du Canada (CRSNG), les Instituts canadiens de recherche en santé Programme stratégique de formation en biologie structurale des protéines membranaires liées aux maladies, et de l'Université de Toronto Bourse ouverte. Ce travail a été soutenu par une subvention des Instituts canadiens de recherche en santé (MOP-67210) pour WAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
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