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Medicine

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

Published: April 13, 2011 doi: 10.3791/2096
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2,3
1Molecular and Cellular Biochemistry, Center for Molecular Neurobiology, The Ohio State University, 2Integrated Biomedical Science Graduate Program, The Ohio State University, 3Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University

Summary

El trasplante de islotes aislados se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1. Aquí se describe un método para aislar los islotes de páncreas de ratón y trasplantarlas en el espacio subcapsular del riñón.

Abstract

Desde los primeros trabajos pioneros de Ballinger y Reckard lo que demuestra que el trasplante de islotes de Langerhans en roedores diabéticos podrían normalizar sus niveles de glucosa en la sangre, el trasplante de islotes se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1 1,2. Más recientemente, los avances en trasplante de islotes humanos han fortalecido aún más este punto de vista 1,3. Sin embargo, dos limitaciones importantes evitar el trasplante de islotes de ser una realidad clínica generalizada: (a) la necesidad de un gran número de islotes por paciente, lo cual reduce considerablemente el número de beneficiarios potenciales, y (b) la necesidad de inmunosupresión pesado, que afecta de manera significativa la población pediátrica de los pacientes debido a su vulnerabilidad a la inmunosupresión a largo plazo. Las estrategias que se pueden superar estas limitaciones tienen el potencial para mejorar la utilidad terapéutica del trasplante de islotes.

El trasplante de islotes bajo la cápsula renal ratón es un modelo ampliamente aceptado para investigar varias estrategias para mejorar el trasplante de islotes. Este experimento requiere el aislamiento de islotes de alta calidad y la implantación de islotes a los destinatarios de la diabetes. Ambos procedimientos requieren pasos de la cirugía que puede ser mejor demostrado por el vídeo que por texto. En este sentido, el documento los pasos detallados para estos procedimientos por el vídeo y el protocolo escrito. También brevemente los diferentes modelos de trasplante: singénico, autoinmunes alogénico, singénico y alogénico autoinmunes.

Protocol

1. Preparación y caracterización de los reactivos Liberase

  1. Este protocolo utiliza Liberase TL (Roche, Cat # 05 401 020 001) de enzimas para la digestión del páncreas.
  2. Compra de 100 a 200 mg a la vez y hacer un gran lote. Vuelva a suspender polvo liofilizado en agua estéril de grado HPLC para que la concentración es de aproximadamente 26 unidades por ml Wünsch. Esta debe ser de aproximadamente 5 mg / ml. Véase el prospecto para obtener información sobre las unidades Wünsch contenidas en el lote. Colocar los viales en hielo durante 30 minutos con los gentiles girando cada pocos minutos. Verificación para asegurarse de polvo se disuelva por completo al final de 30 minutos.
  3. Piscina durante todo el Liberase disuelven juntos y se mezcla con agitación suave (NO vórtice o vibración). Alícuota de 24,3 Wünsch unidades de pre-enfriado tubos Eppendorph, congelación rápida en nitrógeno líquido (lo tratan como cualquier enzimas) y almacenar a -80 ° C. Esta debe ser de aproximadamente 0.935ml por tubo Eppendorph. Cada alícuota es de un solo uso (suficiente para 11 ratones) y no se debe almacenar o volver a congelar una vez descongelado. En general, la población es estable durante al menos 6 meses.
  4. Para cada nuevo lote, calibrar el tiempo de incubación óptimo. Use la acción sin congelar, las acciones recién disuelto, para la calibración, para imitar las condiciones experimentales reales tanto como sea posible.
    1. Calibrar el baño de agua que va a utilizar exactamente a 37 ° C utilizando un termómetro de mercurio. Use la misma incubadora en futuros experimentos.
    2. Antes de utilizarlo, descongele un tubo de Liberase en hielo y añadir (0.935ml) a 21.6ml suero libre de RPMI, por lo que la concentración final de trabajo 1,08 unidades por ml Wünsch. Suero, BAS y EDTA inhiben Liberase. El zinc y el calcio son cofactores. Guárdelo en hielo y el uso en 1,5 horas. Esto es suficiente para alrededor de 11 ratones (2ml/mouse).
    3. Ver el paso 2.3 para la perfusión del páncreas. Perfundir los ratones como sea posible en 1 hr. A continuación, utilice uno o dos ratones para cada tiempo de incubación y la prueba de 10, 12, 14, 16, 18 minutos los tiempos de incubación. Si es posible, incluir intervalos de 30 segundos entre los tiempos como el momento de la digestión es muy importante.
    4. Completar el protocolo de aislamiento de los islotes y analizar el rendimiento y la calidad de los islotes a partir de cada punto del tiempo de incubación. En última instancia, el rendimiento no debe cambiar mucho entre horas punta, pero la calidad de los islotes en los intervalos puede variar. Para los experimentos posteriores, utilice las condiciones que dan lugar a la mayor cantidad de islotes que están sanos 48 horas después de su aislamiento. La edad de los ratones parece afectar el tiempo de incubación óptimo. Por lo tanto, utilizar ratones dentro de un rango de edad similar. Lo ideal es utilizar 8-12 semanas de edad, los ratones, sin embargo, incluso los ratones 80-10 meses de edad puede producir islotes bien. Para la calibración, el uso ratones más jóvenes.

2. Procedimiento Quirúrgico

  1. Prepare todo el equipo y los medios de comunicación antes de la eutanasia a los ratones donantes islote.
    1. Autoclave o llama esterilizar los instrumentos antes de su uso. Todos los reactivos y los instrumentos (tocar las muestras) debe ser estéril. El aislamiento y la recolección a mano de los islotes se pueden realizar fuera de una campana de flujo laminar sin aumentar la incidencia de la contaminación. Sin embargo, la esterilización de los instrumentos que entran en contacto con el páncreas o islotes es fundamental para evitar la contaminación. Las herramientas que se necesitan los siguientes:
      • 1 par de tijeras de disección de la incisión abdominal.
      • 2 pares de pinzas.
      • 1 pinza hemostática para sujetar el conducto biliar.
      • 0.419 mm de diámetro de malla de alambre.
      • 0,1 mm de diámetro de malla de nylon.
    2. Doblar varias agujas de calibre 27 para que un ángulo de 70 grados se introduce aproximadamente la mitad de la longitud de la aguja. El borde biselado de la aguja debe mirar hacia el interior del codo.
    3. Llenar una botella de spray con un 70% de etanol.
    4. Establecer un microscopio de disección con una fuente de luz adecuada en una mesa de laboratorio o en una campana.
    5. Pre-chill centrifugación a 4 ° C. Centrífuga debe tener un rotor basculantes, ser capaz de 900xG, la nevera, y tener un descanso que puede ser desactivado. En un Sorvall RT6000D con el rotor Sorvall H1000B, una velocidad de 2400 rpm es 900xG. Más lento gira se realiza en 800RPM.
    6. Coloque los siguientes reactivos en hielo.
      • RPMI (1 litro con 10% de suero)
      • RPMI (200 ml sin suero)
      • Tubos cónicos de 50 ml (1 por cada páncreas)
      • Jeringa de 5 ml.
    7. Equilibre Histopaque1077 a la habitación de Temperatura.
    8. Descongelar una alícuota de un solo uso de Liberase calibrado en el hielo y se diluye en 22.5ml suero libre de RPMI. Suero, BAS y EDTA inhiben Liberase. El zinc y el calcio son cofactores. Guárdelo en hielo y el uso en 1,5 horas. Esto es suficiente para alrededor de 11 ratones (2ml/mouse).
    9. Caliente 37 ° C baño de agua.
    10. Tenga a la mano como los ratones que puedas canular en 1 hora (aproximadamente 10 a 18 ratones).
  2. Preparar para la canalización del ratón. En primer lugar la eutanasia a los ratones por dislocación cervical o asfixia de CO 2. Mientras que el ratón está por expirar, llenar la jeringa de 5 ml con 2 ml de archivo Liberase de trabajo (1,08 unidades Wünsch / ml).
    1. Coloque el cursor en la posición en decúbito supino sobre una toalla de papel en el microscopio de disección y rociar el abdomen con etanol al 70% antes de la apertura de su abdomen con una incisión en V de la región púbica en ambas piernas delanteras. Pliegues de la piel sobre el pecho para revelar la cavidad abdominal.
    2. Coloque el ratón con la cabeza apuntando hacia usted. Busque la entrada del duodeno en el conducto biliar común tal como se destaca en la Figura 1. Esto se puede hacer sin mirar por el objetivo de disección.
    3. Abrazadera de la apertura del duodeno con pinza hemostática como se muestra en la Fig. 2. Posición de la abrazadera es fundamental para bloquear el flujo de Liberase en los intestinos. Si la abrazadera está demasiado alto o demasiado bajo, Liberase no perfusión del páncreas. Hemostato posición, de modo que cuando se comprime, se ejecuta exactamente a lo largo de la frontera de páncreas / intestino.
  3. Antes de canular el conducto biliar común, puede ser necesario volver a colocar el hígado al presionar hacia arriba contra el diafragma, por lo que la longitud total del conducto biliar común está expuesta (Fig. 3). Una vez que la longitud de las vías biliares expuestos, utilice la inclinación de 27 gague aguja de la jeringa llena Liberase para la canalización. Existen dos técnicas para canular la vía biliar.
    1. En la primera técnica, o el método de 'manos libres', la pinza sujeta en el duodeno se separa de la cabeza del ratón hacia la cola para que el conducto biliar común se tensa. Hay una confluencia en el cierre del conducto biliar hasta el hígado donde la bilis que sale de la vesícula biliar y las enzimas del hígado se unen antes de entrar en los intestinos. El interior de la V formada por esta confluencia se expone tirando de la vía biliar apretado y es un lugar ideal para iniciar la canalización del conducto (Fig. 4). Si se coloca correctamente, la aguja se deslice a través del derecho de V, y directamente canular la parte inferior del conducto. Inserte la aguja varios milímetros en el conducto antes de la dispensación de la Liberase. Colocación de la aguja óptima es importante para evitar el reflujo en el hígado y la vesícula biliar. Además, es importante que la aguja se inserta hasta el momento que obstruye el conducto del bazo. El conducto del bazo es difícil ver las ramas de la vía biliar y los desagües de la cola del páncreas, bazo, una zona rica islote. Si la aguja se deslice más allá de la abertura para el conducto del bazo, no será inferior a la perfusión completa de la cola del bazo y la digestión se reduce potencialmente de esta zona. Rendimiento óptimo de los islotes se produce cuando la profundidad de la aguja es lo suficientemente lejos que no Liberase escapa a la vejiga del hígado / vesícula, pero no tan lejos que has pasado el conducto del bazo. Puede probar con éxito para la canalización mediante la supresión de una pequeña cantidad de Liberase. Si usted ve el Liberase llenado del conducto entonces prescindir del resto de la 2mls. Si el área alrededor del conducto comienza a llenarse, dejar de dispensar, vuelva a colocar la aguja y vuelva a intentarlo.
    2. En la segunda técnica, o el método de "ayudar a los fórceps, la pinza sujeta en el duodeno se separa de la cabeza del ratón hacia la cola para que el conducto biliar común se tensa. Luego, utilizando la inclinación de 27 gague aguja a la jeringa de 5 ml, perfore la fascia por debajo del conducto biliar común cerca del hígado. Utilice la aguja para limpiar la fascia del conducto (Fig. 5). Con la aguja en su lugar, establezca la pinza hacia abajo y recoge un par de pinzas. Use un brazo de la pinza abierta para levantar el conducto biliar, donde la aguja ha despejado la fascia. Las crestas de las pinzas de crear un aparato que puede usar para guiar la aguja en el conducto. Al tirar del conducto y las pinzas hacia usted, deslice la aguja en el conducto con las pinzas como respaldo. Prueba para la canalización mediante la supresión de una pequeña cantidad de Liberase. Si el conducto se empieza a llenar (Fig. 5 Arrow), vierta el resto de la 2mls. Si el área alrededor del conducto comienza a llenarse, dejar de dispensar, vuelva a colocar la aguja y vuelva a intentarlo.
  4. A medida que el 2mls de Liberase llena el páncreas, la zona cercana al duodeno comienza a expandirse en primer lugar, seguida por la región en la parte superior del estómago, y por último la cola del bazo (Fig. 6). Buscar incluso la expansión del páncreas (Fig. 6). Si un área comienza a expandirse y que no se ve el tejido blanco de manera uniforme en expansión y tendido, es probable que el conducto biliar común no ha sido canulado, sin embargo, que la aguja está dentro de la cápsula del páncreas. Llenado de la cápsula con Liberase no resultará en un rendimiento más alto del islote de la superficie expuesta a la enzima se baja. Si esto ocurre, deje de perfusión y la posición de la aguja.
  5. Una vez que el páncreas se ha perfundido, puede ser removido de el ratón tirando de él libre de los puntos de contacto con los intestinos, el estómago y el bazo. Comience por quitar la pinza del duodeno. A continuación, utilice las pinzas para levantar el duodeno y el páncreas por separado de los intestinos con un segundo par de pinzas (FIG.7A-B). Esto se hace mediante la celebración de la segunda pareja de pinzas constante al tiempo que tira los intestinos fuera del abdomen. A continuación, tire del páncreas libre de la parte superior del estómago y el bazo (FIG.7C-D). Por último, levantar el páncreas del abdomen y cortar las conexiones libres de fascia restantes (FIG.7E-F).
  6. Coloque el páncreas en un tubo cónico de 50 ml y se deja en el hielo mientras se trabaja en los otros ratones. Iniciar un temporizador de 1 hora. Para un rendimiento máximo de los islotes, único lugar donde un páncreas en cada tubo. No se recomienda dejar el páncreas perfundido en hielo durante más de una hora, ya que el Liberase se comienzan a degradar el tejido. Al final de la hora, inmediatamente vaya al paso 3.0 para todos los páncreas que fueron perfundidos.
  7. Repita los pasos 2,3 a 2,6 para el resto de los ratones o hasta que el temporizador de una hora comenzó en el Paso 2.6 ha caducado.

3. Islotes purificación del páncreas perfundido

  1. Antes de los islotes pueden ser purificados por el páncreas, el tejido debe ser digeridos a 37 ° C. Grupo de los 50 ml de tubos que llevan el islotes perfusión en un bastidor de fondo abierto que encaja en el baño de agua a 37 ° C. Asegúrese de que todas las tapas estén bien asegurados y las trompas de sumergirse en el baño de agua a 37 ° C para la cantidad exacta de tiempo pre-determinado por el actual grupo de Liberase (Vea el paso 1.4). Al final de la incubación, mover los tubos de hielo y agregue RPMI1640 con 10% de suero de 20mls por tubo. Suero que contiene los medios de comunicación se detendrá la digestión Liberase.
  2. Disociar el tejido agitando los tubos vigorosamente 40 veces en 10 segundos. Este paso es esencial para una recuperación óptima de los islotes. Incluso con la perfusión Liberase óptima y el tiempo bien calibrada la digestión, el rendimiento de los islotes será baja si el tejido no se rompe. El manejo agresivo de los ejemplos de este paso no parece dañar los islotes de ratón y es necesario para liberarlos de los cúmulos de células exocrinas.
  3. Para separar los islotes del páncreas digeridos, siga los siguientes pasos.
    1. Piscina digerido páncreas por lo que hay alrededor de 2,5 páncreas por tubo. De este modo, diez tubos se condensa a cuatro tubos con 50mls de los medios de cada uno.
    2. Centrifugar los tubos durante 2 minutos a 800RPM y 4 ° C.
    3. Retirar el sobrenadante y resuspender las pastillas en 15 25mls los medios de comunicación con FBS al 10% por agitación suave (ajustar la intensidad del vórtice a aproximadamente el 50% del máximo) durante varios segundos.
    4. Vierta la mezcla se resuspendieron a través de la malla de alambre 0.419mm y el embudo en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Esto separa a la no digeridas tejido, la grasa y la linfa. Enjuagar el tubo inicial con un adicional de 10ml de los medios de comunicación que contiene 10% de SFB y se vierte a través de la malla de alambre. Repita este proceso para los tubos restantes.
    5. Centrifugar los tubos durante 2 minutos a 800RPM y 4 ° C.
    6. Retirar el sobrenadante y cuidadosamente invertir los tubos en una toalla de papel. Reloj para asegurarse de que los islotes no resbale. Limpie el interior de los tubos con una toalla de papel para eliminar los medios de comunicación residual, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. Volver tubos en posición vertical.
    7. Resuspender los pellets en 5ml de la temperatura ambiente histopaque1077 por agitación suave durante varios segundos. Asegúrese de que la suspensión sea homogénea antes de agregar un adicional de 5mls HISTOPAQUE en todo el interior del tubo. Esto lava los islotes de la pared del tubo.
    8. Superposición HISTOPAQUE con 10ml de suero libre de RPMI, teniendo cuidado de mantener una interfaz clara entre el HISTOPAQUE y los medios de comunicación. Añadir los medios de comunicación con la pipeta lentamente por el lado del tubo a una velocidad de 1 ml por cada 10 segundos. Los medios de comunicación debe estar en la parte superior, y HISTOPAQUE en la parte inferior. Suero afecta a la densidad de los medios de comunicación y no debe ser utilizado durante esta etapa.
    9. Girar las muestras en una centrífuga de equilibrio a 20 ° C a 2400 rpm (900xG) durante 20 minutos con una aceleración muy lenta y frenado no. Este paso separa los islotes de las células exocrinas. Los islotes se migran a la relación entre los medios de comunicación libre de suero y Histopaque mientras que las células exocrinas will forma una bolita en la parte inferior del tubo.
    10. Recoge los islotes de la interfaz de HISTOPAQUE / media con una pipeta serológica de 10 ml desechables. Islotes se adhieren al cristal, por lo tanto, pipetas de vidrio no debe utilizarse a menos que hayan sido con silicona. Lugar islotes en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Varios tubos se pueden agrupar en este momento. Llenar los tubos de 50 ml con RPMI suero que contiene.
    11. Centrifugar los tubos durante 2 minutos a 800RPM y 4 ° C.
    12. Retirar el sobrenadante y resuspender los islotes en 50mls de RPMI suero que contiene por agitación suave.
    13. Centrifugar los tubos durante 90 segundos a 800RPM y 4 ° C.
    14. Retirar el sobrenadante y repetir el lavado 1 vez más.
    15. Retirar el sobrenadante y tomar los tubos de la campana de cultivo de tejidos. Añadir penicilina / estreptomicina a RPMI 10% FBS a una concentración final de 1% para los medios de cultivo de islotes. Resuspender los islotes en 5ml de este medio de cultivo.
    16. Invertir un colador de nylon de células 0,1 mm y colocarlo en un tubo cónico de 15 ml. Poco a poco pasar a la suspensión de los islotes se resuspendieron a través del filtro. Los islotes será retenido por el filtro, mientras que las células exocrinas pasar por dentro del tubo cónico de 15 ml. Este paso aumenta considerablemente la pureza de los islotes con respecto a la contaminación de células exocrinas en el final del protocolo.
    17. Enjuagar el tubo cónico de 50 ml con una 6mls adicional de los medios de comunicación y la pipeta a través del colador.
    18. 3mls lugar de medios de cultivo como una gran caída en una placa de Petri de 10 cm. Invertir el filtro celular lado derecho hacia arriba, de modo que la superficie utilizada para la captura de los islotes se puede sumergir en la caída de los medios de comunicación. Tocar el filtro de los medios de comunicación de transferencia de la mayoría de los islotes en una cultura de no-tejido tratado placa de Petri. El uso de un plato de Petri no tratados es fundamental para evitar la adhesión del islote y la dispersión en la superficie de la placa. Libre de islotes flotantes son mucho más fáciles de recoger para la separación en grupos experimentales.
    19. Pipeta de un adicional de 5 7mls de medios de cultivo a través del filtro en la placa de Petri para lavar cualquier residuo fuera de los islotes del filtro en el plato.
    20. Comprobar el rendimiento de los islotes y la calidad en un objetivo de 4x en un microscopio invertido. Girando el plato en un óvalo estrecho recogerá los islotes en el centro del plato. Si los islotes se ven bien, que puede ser recogido de inmediato para su uso experimental o separados de manera uniforme entre las placas de Petri de 10 cm 04.06 (por cada 10 ratones). Islotes de cultivo demasiados en el mismo plato las causas de los islotes que se necrosan y se degradan. Para los experimentos, 250-300 islotes por plato de 6 cm con 2-3mls de los medios de comunicación no parecen hacer hincapié en los islotes.
    21. Habrá algunos islotes que puedan utilizarse en el tubo de 15 ml cónicos que recogió de la célula de 0,1 mm de nylon de flujo a través de colador. Estos islotes se pueden recuperar después de tres a cuatro rondas de sedimentación por gravedad. Después de aproximadamente 4 minutos de la sedimentación, la aspiración de todos, pero aproximadamente 1 ml de los medios de comunicación del tubo y volverlo a llenar hasta el tope con los medios de cultivo. Tapar el tubo e invierta para mezclar. Repetir este proceso varias veces elimina muchas de las células exocrinas unicelulares que son lentos a los sedimentos, y enriquece los agregados más pesado de células endocrinas (islotes) que rápidamente se hunden. Después de la aspiración final, volver a suspender en 7mls de medios de cultivo y la placa en una placa de Petri fresco.

4. Trabajar con islotes aislados

  1. El proceso de aislamiento es bastante estresante para los islotes; HISTOPAQUE es tóxico, temblando y pasos de centrifugación inducir estrés enorme, y la eliminación de la fuente de acogida de sangre, así como el cultivo in vitro puede inducir la hipoxia. Nosotros y otros han demostrado que el aislamiento provoca muerte de células beta 4.5. El efecto de estas tensiones es visto por el desprendimiento de las células de la periferia de la isleta y el oscurecimiento y la expulsión del núcleo central del islote (necrosis central). Mientras que el desprendimiento de las células de la periferia se puede tolerar, la necrosis central del islote lo descalifica para su uso en experimentos. Por lo general, cuanto mayor sea el islote, mayor será la probabilidad de que la necrosis central será un problema. Esfuerzos encaminados a reducir el aislamiento de los islotes del mensaje de respuesta al estrés aumenta el rendimiento de los islotes utilizable.
  2. Por lo tanto, utilizamos una técnica ya se ha informado de la incubación de los islotes en un 22-27 ° C de cultivo de tejidos incubadora para las primeras 48-72 horas después del aislamiento 8.6. Esta temperatura reducida amortigua la respuesta al estrés islotes y suaviza la transición en el cultivo in vitro. Si un 22-27 ° C incubadora de cultivo de tejidos no está disponible, es posible alcanzar el rango de temperatura deseada en un nivel de cultivo de tejidos incubadora apagando el control del calor y la colocación de aproximadamente 20 libras decongelador a -80 equilibrada ladrillos ° C. Esto se traduce en alrededor de 16 24 horas de temperatura más baja en la incubadora. Vuelva a colocar el congelador -80 ° C ladrillos, según sea necesario. No hemos observado un beneficio adicional de la incubación a esta temperatura baja más de 72 horas.
  3. Además de la incubación a baja temperatura, se recomienda cambiar los medios de comunicación de 24-48 horas después de su aislamiento. Factores secretados por islotes y destacó muertos se acumulan en el aislamiento de los siguientes medios y pueden promover el estrés islote adicionales. Para cambiar el soporte, siga los siguientes pasos.
    1. La transferencia de los medios de comunicación y los islotes de la placa de Petri a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta de plástico.
    2. Lavar la placa con un 3mls adicional de medios de cultivo para recoger islotes residuales.
    3. Añadir este 3mls adicional al tubo cónico de 15 ml y permitir que los islotes de sedimentos gravedad durante 5 minutos.
    4. Aspire todo, pero de 1 ml de los medios de comunicación desde el tubo cónico de 15 ml, a continuación, volver a suspender los islotes en 4mls de medios de cultivo de islotes.
    5. La transferencia de los islotes y los medios de comunicación a un nuevo plato de petri. Añadir un 3mls adicional de medios de cultivo en el tubo cónico de 15 ml para recoger cualquier islotes residuales y agregue esto a la placa de Petri.
    6. Cambiar el soporte de los islotes cada tres a cinco días después.
  4. Al recoger los islotes de un experimento, no se recomienda mezclar los islotes de diferentes aislamientos. La línea de base molecular de los islotes se ve influida por muchos factores, incluyendo la cantidad de tiempo que han estado en la cultura y la tensión de aislamiento que varía de preparación para la preparación. Para reducir la variabilidad, los experimentos de los islotes se debe realizar en los islotes que fueron aislados al mismo tiempo. Sin embargo, si esto no fuera posible, le recomendamos la puesta en común todas las islas en un solo grupo antes de que los recoge para los experimentos. Para recoger los islotes para los experimentos, siga los siguientes pasos.
    1. Si los islotes están incubando en más de un plato, la piscina todos los islotes en un solo plato, siguiendo los pasos 4.3.1 a 4.3.5 anteriores. Si varios platos de los islotes están involucrados, un tubo cónico de 50 ml se debe utilizar en lugar del tubo de 15 ml. Esto puede reducir la variabilidad inducida por sutiles diferencias en las condiciones de cultivo entre las placas durante el período de recuperación post-aislamiento.
    2. Durante verticales de sedimentos de los islotes, establecer un microscopio invertido equipado con un objetivo de 4x o 10x. Recoge una micropipeta p200 y una caja de estériles p200 consejos.
    3. La transferencia de los islotes sedimentado una sola placa y mover la placa al microscopio. Agite el plato para recoger las isletas en el centro. Retire la tapa de la placa y el uso de la pipeta para recoger p200 islotes saludable. Islotes sanos tienen fronteras sin problemas y no las regiones centro oscuro (Figura 8). Trate de mantener una distribución uniforme de tamaños de los islotes a lo largo de los platos experimentales como el tamaño de los islotes pueden alterar la respuesta al tratamiento.
    4. El número de islotes por grupo experimental puede variar en función de las necesidades del experimento. Estimamos que un islote tiene aproximadamente 1000-2000 células y rendimiento de 0.3 1 g de proteína y 25 ng de ARN total. Para los ensayos in vitro, un grupo experimental típica puede ser de entre 100 y 250 islotes se sembraron en 35 mm o 6 cm de platos con 1-3ml de los medios de comunicación. Para el trasplante, cada ratón receptor requerirá entre 150 y 400 islotes, según el diseño experimental (ver paso 5.2.2 y discusión para más detalles).
    5. Para reducir al mínimo las variaciones introducidas por el proceso de recolección a mano, usamos el orificio de la punta de la pipeta p200-como una guía para estimar el tamaño de los islotes. La mayoría de los islotes tienen un diámetro de aproximadamente la mitad del diámetro del orificio, y contamos con cada uno de ellos como un islote estándar. Cualquier islotes más grandes o más pequeños que eso, se le asigna un número diferente de islotes en consecuencia. Recopilamos islotes en lotes de 20 a 50 y transferirlos a los platos designado experimental. Si el p200-pipeta se fija en el volumen de 180 microlitros, se puede recoger varios islotes (por lo general más de 50 islotes) en un extremo. Por lo tanto, a pesar de que los islotes son recogidos uno a la vez, se pueden recoger muchos islotes dentro de cada p200-punta a través del control del mecanismo de liberación Pipetman. Esto facilita la recogida de cientos o incluso más de un millar de islotes necesarios para los experimentos. También utilizamos esta operación por lotes para ayudar a equilibrar la distribución de los islotes con calidad y tamaño similar.

5. Subcapsular renal El trasplante de islotes

  1. Inducir la diabetes en los ratones receptores del trasplante.
    1. Ratones a cabo un ayuno de 4 horas a 6. Receptores de trasplantes óptima debe ser de 6 a 10 semanas de edad y pesan de 20 a 25 gramos en el momento de rápido. Para avanzar rápido que los ratones, eliminar la comida de la feeding bastidor y coloque siempre los ratones en una jaula nueva. Esto garantiza un verdadero ayuno, por la separación de los ratones de todos los trozos residuales de los alimentos que previamente haya caído en su jaula. Plan de 80% a 90% de los ratones para convertirse en diabéticos.
    2. Tres horas en el ayuno, prepara el tampón citrato de sodio. Pesar 0.735g de citrato de sodio grado enzima (citrato de Na, el Sr. 294,10 g / mol) y se disuelven en 25mls de agua destilada estéril. Ajustar el pH a 4,5 con HCl. Este buffer debe ser fresca para cada ronda de experimentos.
    3. Lugar 0.05g estreptozotocina (STZ, M r 265,2 g / mol) en un tubo de 1,5 ml Eppendorph. Esta cantidad es suficiente para inducir la diabetes en aproximadamente 8 ratones. Preparar un número adecuado de tubos de 1,5 ml para el número de ratones que se inyecta. STZ es sensible a la luz, por lo que cubre cada tubo con papel de aluminio.
    4. Después de 4 horas de ayuno, volver a suspender uno de los tubos de STZ con 1 ml de recién hechas Na tampón citrato. Una vez resuspendido, la solución de citrato de Na-STZ pierde su actividad dentro de los 15 a 20 minutos, por lo que este paso sólo debe realizarse inmediatamente antes de inyectar a los ratones.
    5. Se inyecta por vía intraperitoneal cada ratón con un volumen adecuado de la solución de citrato de Na-STZ para alcanzar una dosis final de 190mg/kg ratón. Esta dosis puede variar según la cepa y la edad del ratón, por lo tanto puede ser necesario realizar una optimización de la dosis si la incidencia de diabetes es muy baja o si los ratones son demasiados los que mueren en los 3 a 5 días después de la inyección. Las dosis usuales empleadas van desde 150mg/kg 250mg/kg ratón a ratón.
    6. Suministro de alimentos y el agua una vez que todos los ratones se han inyectado.
    7. Los ratones de ensayo para la hiperglucemia en ayunas (> 350mg/kg) 2 a 4 días después de la inyección. Los ratones que demuestran 3 días consecutivos de no hiperglucemia en ayunas puede ser utilizado como receptores de un trasplante.
  2. Preparar para el trasplante de islotes
    1. Aislar islotes como se describió anteriormente en los pasos 2.0 a 4.0. Si es necesario, los islotes pueden ser aislados en el día del trasplante o antes.
    2. Elige islotes en grupos de trasplante por su inclusión en el estéril 1,5 ml tubos Eppendorph. Mantenga los tubos en hielo. El número de islotes necesarios para restaurar la normoglucemia puede variar debido a las condiciones del experimento (cepa islote de donantes, el peso y la tensión del receptor, y ningún tratamiento adicional proporcionada al beneficiario) y la persona que está recogiendo los islotes. El tamaño del ratón receptor es una variable importante que influye en el número de islotes mínimos, como los ratones más grandes requerirán más islotes. Constantemente encontramos que 150 a 250 islotes sólo marginalmente, mientras que restaura la normoglucemia 300 islotes o más es curativa en un 18 a 20gram C57BL / 6 ratón receptor. En estos experimentos, los ratones eran islotes de donantes C57BL / 6 o ratones Balb / c.
  3. Islotes de trasplante renal subcapsular a la bolsa
    1. Reunir los materiales siguientes (todos los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados):

      Tabla 1. Equipo de Trasplante de
      25μl jeringa Hamilton 6 "de la PE 50 tubos flexibles de corte para un lado está biselado
      Gel de carga y p200 puntas de pipeta Tubos estériles Eppendorph (1 por beneficiario)
      Vaporizador isoflurano y el isoflurano Eppendorph Gradilla
      McPherson-Vannas Tijeras (1) Pinzas de brazo doblado (2)
      Hemostatos (1) Herida clip con clips
      Calibre 27 agujas Llama tiró sondas capilar de vidrio del tubo *
      Algodón bastoncillos Tubo cónico de 50 ml de PBS estéril
      Suturas Tijeras eléctricas
      70% de etanol botella de spray Bolígrafo
      Betadine claro campo estéril de plástico


      * Nota: En la preparación de estas sondas, intento de crear un arco en la investigación que imita el ángulo de los riñones del ratón. Además, asegúrese de que el final de la sonda se haya flameado pulido para que no existan bordes afilados.
    2. Pesar y etiquetar todos los ratones receptores diabéticos. Asigne a cada ratón a un grupo experimental antes del trasplante para que cada grupo también ha emparejado el peso corporal.
    3. Establecer un campo quirúrgico dentro de un capó abierto equipado con la salida de gas del vaporizador isoflurano.
    4. Anestesiar a un ratón receptor con isoflurano y luego afeitarse su flanco con las tijeras eléctricas. Afeitar el ratón fuera de la zona donde los trasplantes se llevarán a cabo.
    5. Retorno del ratón a la anestesia y la posición perpendicular a la mentira y directamente sobre el eje de una varilla de vidrio para que el flanco afeitado hacia arriba. Rocíe el costado con un 70% de etanol. El ratón es que se prepara con un lavado quirúrgico de la alternancia betadine y alcohol se repite tres veces. Coloque el ratón con la cortina transparente estéril que permite el acceso a la banda afeitado.
    6. Prepare los islotes para trasplantes, mientras que el ratón se está anestesiado. Para ello, completando los siguientes pasos.
      1. Coloque una punta de carga de gel estéril en la apertura de un tubo de 1,5 ml Eppendorph modo que hay una curva suave que se hace en forma de U en el extremo angosto de la punta. La apertura de la punta debe estar mirando directamente hacia fuera del tubo Eppendorph. No introduzca un punto de torsión en cualquier punto de la punta de la carga de gel, ya que provocaría en la esquila de los islotes y una reducción en el número de islotes que se trasplantan.
      2. Retire con cuidado a partir de un tubo de hielo de los islotes que se preparó en el paso 5.2.2. Todas las islas deben resolverse en la parte inferior del tubo. Con una pipeta p200, suavemente recoger los islotes en un volumen mínimo de la parte inferior del tubo. La transferencia de estos islotes a través de la gran apertura de la punta de carga de gel preparado en el paso 5.3.6.1. Los islotes debe asentarse en la longitud del estrecho o angosto restricción de la punta de carga de gel.
      3. Después de los islotes se han sedimentado, eliminar la mayor cantidad de los medios de comunicación de la punta de carga de gel como sea posible. Esto se puede lograr usando una punta de carga de gel fresco unido a una pipeta aspirando p200 los medios de comunicación a través de la gran apertura de la punta del islote gel portador de carga.
      4. La transferencia de los islotes sedimentado en la PE 50 tubos flexibles (~ 15 cm de longitud). Esto se puede hacer en primer lugar, uniendo el extremo no biselado del tubo a la estrecha abertura de la punta del islote gel portador de la carga antes de conectar la punta de una pipeta de p200. Los islotes puede ser empujado a través del 60% de la longitud de la tubería.
      5. La transferencia de los rodamientos islote PE 50 tubos a una jeringa Hamilton 25μl. Asegúrese de que el émbolo de la jeringa se ha retirado antes de transferir el tubo. Conecte el extremo no biselado de la tubería de PE 50 a la aguja de la jeringa.
      6. El émbolo de la jeringa hasta que los islotes son de aproximadamente 0,5 cm de distancia de la apertura biselada.
      7. Ponga la jeringa a un lado para que los islotes pueden resolver en una sola masa cerca de la apertura biselada de la sonda, mientras que el riñón se está preparando para recibir los islotes.
    7. Con los dedos, localizar el riñón a través de la piel del ratón bajo anestesia. El eje de la pluma de punta de bola debe estar directamente debajo de la zona donde se encuentra el riñón y se coloca perpendicular a la médula espinal.
    8. Una vez que el riñón es localizado, el uso de las tijeras McPherson-Vannas que hacer una incisión de 2 cm a través de la dermis directamente encima de él en una dirección perpendicular a la médula espinal. Esta incisión se exponen a la pared peritoneal.
    9. Con las tijeras McPherson-Vannas hacer una incisión de 1 cm en la pared peritoneal en la misma dirección que el corte a través de la capa dérmica. Es importante que la apertura creada por la incisión sea menor que el riñón está expuesto.
    10. Utilizando el eje de la varilla de vidrio como un respaldo, la fuerza de los riñones a través de la apertura peritoneal presionando hacia abajo el the la superficie adyacente. Si la apertura es ligeramente menor que el riñón, el riñón va a pasar a través de la apertura y el resto de forma estable en la superficie del ratón sin ningún tipo de manipulación adicional o contacto. Esta posición es ideal para el trasplante de los pasos siguientes. Si la abertura es demasiado grande, el riñón va a volver a caer en la cavidad peritoneal, lo que hace difícil completar los pasos siguientes.
    11. Humedezca la superficie del riñón expuesto con helada PBS estéril con un algodón empapado con punta aplicadora. Repita este paso cada pocos minutos o según sea necesario para evitar que la cápsula renal de la desecación.
    12. Con la aguja de calibre 27, hacer una incisión a través de 0,2 cm de la cápsula del riñón a través de la superficie anterior del riñón en movimiento desde el lado lateral a la izquierda hacia la parte lateral derecha.
    13. Utilizando la llama sacó la sonda de tubo de vidrio capilar, crear una bolsa entre la cápsula renal y el parénquima renal. Hacerlo mediante la inserción de la sonda a través de la incisión hecha en el paso 5.3.12 y se mueven en una dirección posterior a lo largo de la superficie dorsal-lateral del riñón. Una sonda ideal tendrá una curva en la que coincide con el arco natural de esta superficie de los riñones. Esto permitirá a la sonda para llegar al final más posterior del riñón sin que se rompa abrir una abertura anterior de gran tamaño. Es importante hacer esta bolsa tan larga y estrecha como sea posible. Corto bolsas de ancho no son ideales ya que permiten a los islotes de escapar de la cápsula. Bolsas largas y estrechas permiten los islotes que se depositan hacia el extremo posterior del riñón con una mínima pérdida de la bolsa capsular.
    14. Recuperar el 25μl jeringa Hamilton preparado en el paso 5.3.6 y mover los islotes hasta el mismo borde de la abertura biselada del tubo flexible.
    15. Inserte el borde biselado del tubo flexible en la bolsa subcapsular preparado en el paso 5.3.13. El borde biselado debe quedar hacia arriba, de modo que el borde más largo está en contacto con el parénquima renal. Mover el tubo hasta el final más posterior de la cápsula.
    16. Poco a poco la transferencia de los islotes de la PE 50 tubo en la bolsa subcapsular por el émbolo de la jeringa. Como los islotes de llenar la bolsa lentamente el tubo flexible a cabo haciendo más espacio para los islotes que se depositará. Asegúrese de que todas las islas se transfieren desde el tubo en la bolsa. No llene la bolsa con el aire o el exceso de líquido.
    17. Después de retirar el tubo de PE 50 de la bolsa, el uso de la llama sacó la sonda de tubo de vidrio capilar para empacar con cuidado los islotes en el extremo proximal de la bolsa. Para ello, deslizando la sonda de vidrio a lo largo de la superficie externa del riñón se mueve en una dirección anterior a la posterior. Tenga cuidado de no hacer las maletas de los islotes con demasiada fuerza como el extremo posterior de la bolsa subcapsular pueden romperse y liberar a los islotes. Este paso reduce al mínimo la pérdida de islotes a partir de la apertura anterior de la bolsa cuando el riñón se vuelve a colocar dentro de la cavidad peritoneal.
    18. Con una pinza brazo doblado levantar la membrana peritoneal adyacente a la abertura hecha por el riñón y luego usar un algodón empapado PBS aplicador con punta para empujar suavemente el riñón en la cavidad peritoneal.
    19. Cerca del ratón mediante la aplicación de las suturas de la pared peritoneal y los clips de la herida a la capa dérmica.
    20. Devolver el ratón a su jaula y repita los pasos 5.3.4 a través de 05.03.19 para los ratones restantes. Los ratones deben mantenerse caliente con un cojín de la calefacción por debajo de la jaula o una lámpara de calor con los ojos protegidos hasta que el ratón se recupera totalmente de la anestesia. Los animales deben estar provistos de acetominophine en el agua (6 mg / ml).
    21. Cheque no de sangre en ayunas los niveles de glucosa 24 horas más tarde. Todos los ratones se normoglucemia (glucosa en sangre <200mg/dl) en el día después de la operación (POD) 1.

6. Resultados representante

Dos procedimientos principales se describen en este protocolo: (1) aislamiento de los islotes y (2) el trasplante de islotes bajo la cápsula renal. En el procedimiento de aislamiento de los islotes, los rendimientos de los islotes suelen oscilar entre 100-150 islotes por ratón en función de la edad y la tensión. La pureza de estas islas con respecto a su separación de las células exocrinas del páncreas pueden variar ampliamente entre cada preparación. Sin embargo, el uso de Histopaque1077 a temperatura ambiente en el paso 3.3.7 y un filtro de nylon de 0,1 mm en el paso 3.3.17 suelen permitir la pureza superior al 99% de los islotes. Esta pureza se alcanza antes de la recolección manual adicional de islotes. Imágenes representativas de la aislamiento de islotes continuación se muestra en la Figura 8D. Como se ve en estas imágenes, los islotes suelen tener un borde áspero aislamiento periférico inmediatamente después. Sin embargo, con el tiempo en la cultura, islotes saludable adquirir y mantener un borde suave (Figura 8D). En algunas islas, una región central de necrosis se desarrollará,aparece como una zona oscura en el núcleo. Este centro necrótico a menudo es expulsado del islote como se recoge en time-lapse de imágenes (video suplementario 1). Los islotes restantes aparecen huecos en el centro (datos no mostrados) y, presumiblemente, no funcional. Por lo tanto, se excluyen los islotes con centro oscuro durante el proceso de recogida a mano. Es importante el descubrimiento de que una baja temperatura de incubación tras el procedimiento de aislamiento (Paso 4.2) puede reducir drásticamente el número de islotes que se desarrollará necrosis central en la cultura a través del tiempo.

En el procedimiento de trasplante de islotes, a dos pasos son fundamentales: la inducción química de la diabetes y la entrega de los islotes en el riñón sub-área de la cápsula. Para la inducción de la diabetes, la meta es lograr la hiperglucemia en más del 90% de los ratones inyectados con STZ. Estos ratones sobrevivir sin el trasplante durante varias semanas. La dosis óptima de STZ para lograr este objetivo varía, dependiendo de las cepas de ratón y de la edad, y debe determinarse experimentalmente. Se encontró que una diferencia tan pequeña como 20mg/kg peso corporal puede hacer una gran diferencia. Por lo tanto, una titulación con intervalos estrechos deben llevarse a cabo. Para el trasplante de islotes, una consideración clave es el modelo, que puede tener cuatro contextos inmunológico: singénico, autoinmunes alogénico, singénico y alogénico autoinmunes. En el modelo singénico, la cepa donante es el mismo que la cepa receptora. Así, los islotes no invocar la respuesta adaptativa inmune de los receptores. Esto permite a los investigadores a investigar las cuestiones relacionadas con "primario no funcionar", un término que se refiere a la disfunción del islote y la pérdida debido a otras razones que el rechazo inmune específica de los destinatarios. Principal función no se cree que es la razón principal del fracaso de los islotes en la etapa temprana del trasplante y de la exigencia de un gran número de islotes (páncreas ≥ 2 / paciente) para lograr la euglucemia. Por lo tanto, es un tema crítico para el trasplante de islotes. En este modelo, una masa de islotes marginal que no restaura completamente la normoglucemia se deben utilizar y los ratones deben ser examinados para la glucosa en sangre en la fase inicial después del trasplante, por lo general entre 1 y POD POD 7. En nuestra experiencia, una masa marginal de islotes se encuentra normalmente entre 150 y 250 islotes de tamaño medio por beneficiario de 20 gramos con la cepa C57BL / 6 de ratones. Con el modelo singénico, se puede utilizar genéticamente modificados o farmacológicamente islotes para probar si una modulación particular afecta a la eficacia terapéutica de los islotes en la fase inicial después del trasplante.

En los modelos alogénicos y autoinmunes, los injertos de islotes están expuestos a un ataque inmune específica por el anfitrión de adaptación, la inmunidad, que consiste en los linfocitos T, linfocitos B y otras células inmunes. Adaptativa inmunidad es una respuesta inmune retardada, para analizar esta respuesta, es necesario trasplantar un número de saturación de islotes que se restaura la normoglucemia en la fase inicial después del trasplante para minimizar el impacto de la primaria no la función. Entonces se puede controlar la duración de tiempo antes de que los islotes son rechazadas como se indica por la pérdida de la normoglucemia para determinar los efectos de cualquier modificación de los islotes en el rechazo del injerto. En nuestra experiencia, de más de 300 islotes están obligados por ratón de 20 gramos y de 15 a 21 días son el tiempo de rechazo de un trasplante alogénico con ratones Balb / c (H-2 d) de los donantes y C57BL / 6 (H-2 b) destinatarios.

Figura 1
Figura 1. Localización de la apertura del duodeno en el conducto biliar común. Endógenas enzimas digestivas drenaje del hígado, el páncreas y la vesícula biliar pasar a través del conducto biliar común antes de entrar en el tracto intestinal en el duodeno. La dirección del flujo a través de este conducto se puede revertir si se aplica presión en el sistema mediante la adición de fluido externo. Esto dará lugar a que el páncreas se llene y distendido.

Figura 2
Figura 2. Sujeción de la apertura del duodeno en el conducto biliar común. Con el fin de llenar el páncreas con Liberase, es necesario bloquear la apertura del duodeno en el conducto biliar común. Si esto no se logra adecuadamente, Liberase llenará el intestino en lugar del páncreas.

Figura 3
Figura 3. Reposicionamiento del hígado contra el diafragma permite la visualización de la región proximal del conducto biliar común. Canulación del conducto biliar común se puede lograr con mayor éxito, si se intenta cerca de su extremo proximal (en la confluencia en forma de V se describe en el apartado 2.3.1).

Figura 4
Figura 4. Canular el conducto biliar común por la libre "mano 'método. Una confluencia del conducto biliar común se hace visible cuando la pinza que se fija en el duodeno se estira hacia el extremo posterior del ratón. Canulación del conducto se puede lograr mediante la colocación de la aguja de calibre 27 en esta confluencia y la conducción a través de él.

Figura 5
Figura 5. Canular el conducto biliar común por la 'pinza de ayudar a' método. Como se menciona en el texto, a veces el tejido fascial alrededor del conducto hace que sea difícil canular. (A) En estos casos, es útil para eliminar la capa de la cara con la aguja de calibre 27. (B), el conducto se puede visualizar claramente y con el apoyo de un par de pinzas de brazo doblado. (C) Con las pinzas como tope, la aguja de calibre 27 se inserta en el conducto para la entrega de Liberase.

Figura 6
Figura 6. Incluso la expansión del páncreas indica colocación de la aguja óptima. Dado el carácter translúcido del conducto y los tejidos circundantes fascial, en algunos casos puede parecer que el conducto se ha canulado, cuando en realidad no es así. Si esto ocurre y la aguja penetra en la cápsula del páncreas, la región duodenal del páncreas empezará a expandirse a la entrega de la Liberase. Sin embargo, todo el páncreas no perfundidos y esto se traducirá en el rendimiento de los islotes de baja. Para evitar este problema, para ver incluso la expansión del páncreas, específicamente, en busca de signos de la enzima de entrar en la región del páncreas unido a la parte anterior del estómago.

Figura 7
Figura 7. Extracción del páncreas perfundidos. Para extirpar el páncreas de los ratones, hay varios puntos de contacto con las vísceras debe ser roto. (AB) Separar el páncreas de los intestinos. (C) Separar el páncreas desde el estómago. (D) Separar el páncreas de los intestinos. (EF) Corte contactos permanecen en la cavidad peritoneal.

Figura 8
Figura 8. Imágenes representativas de los islotes. La relativa pureza y la calidad de los islotes se puede estimar el microscopio una vez finalizado el procedimiento de aislamiento. (A) Si bien el objetivo es purificar los islotes del páncreas, las células exocrinas y escombros en ocasiones se presentan. (B) la tensión de aislamiento de los islotes pueden inducir la muerte celular que se manifiesta como oscura regiones centrales de los islotes y la descamación de las células de la periferia del islote. (C) Al escoger islotes para un experimento, evitar la captación de las células exocrinas contaminantes. (D) Islotes cambio en la apariencia con el tiempo en la cultura. Como islotes recuperarse de aislamiento, que adquieren una superficie periférica suave. De vez en cuando en las grandes islas una región central oscura es visible. Estas células se tiñen positivamente para la muerte celular.

Vídeo suplementario 1. Lapso de tiempo de microscopía de islotes aislamiento posterior. En este video de lapso de tiempo 16hr los islotes se puede ver el desarrollo de centros necróticos que son finalmente expulsados. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo .

Discussion

En los apartados anteriores, se describen los pasos detallados para el aislamiento y el transplante de los islotes pancreáticos de ratón. En este sentido, destacar brevemente los pasos que son críticos para el éxito de los procedimientos.

1. Aislamiento de islotes

Los pasos clave son la identificación de un momento óptimo digestión enzimática (1,4), el posicionamiento de la pinza hemostática sobre la abertura duodenal del conducto biliar común (2.2.3), canulación del conducto biliar común (2,3), una agitación vigorosa del páncreas después de los 37 ° C digerir (3,2), y la eliminación de la contaminación de células exocrinas (3.3.7 y 3.3.16). Estos pasos tienen una gran influencia en la calidad, el rendimiento y la pureza de los islotes. Quizás el paso más difícil técnicamente es la canalización del conducto biliar común. En muchos ratones, el conducto biliar común puede ser difícil de visualizar debido a la fascia que rodea. Por lo tanto, es común que los intentos para canalizar el resultado del conducto biliar común en la penetración del tejido facial solamente. En estos casos, la Liberase comienza a llenar el tejido conectivo circundante y no perfusión del páncreas. Si esto se detecta, detener el flujo de Liberase y la posición de la aguja para que penetre en el lumen de la vía biliar. Con la práctica, es posible identificar rápidamente la posición óptima para la colocación de la aguja y para completar la canalización sin dañar el conducto friable.

2. El trasplante de islotes

Los pasos críticos son la inducción de la diabetes con STZ (5,1) y la prestación eficiente de los islotes de la bolsa subcapsular (5.3.14-5.3.16). STZ es un análogo de la glucosa natural que es selectivamente tóxica para las células de la secreción de insulina de las células β de los islotes 9. Sin embargo, esta toxicidad selectiva se produce en un rango de concentraciones relativamente estrecho. Prueba de ello es el hecho de que altas dosis de STZ puede resultar en un rápido (2-3 días) letalidad en ausencia de hiperglucemia. Por lo tanto, se debe tener cuidado para identificar la dosis óptima de STZ de la cepa y la edad de los ratones se utiliza antes de los experimentos a gran escala se inició. La entrega física de los islotes de la bolsa subcapsular es también un paso clave. Para lograr resultados consistentes, es imprescindible para reducir al mínimo la pérdida de islotes en su entrega. Esto puede ocurrir si hay defectos o roturas en la cápsula renal que cubre la bolsa o si el volumen inyectado es demasiado grande. El daño a la cápsula se puede evitar la manipulación suave y cuidadosa, y mediante el uso de la sonda de cristal liso para preparar la bolsa subcapsular. Además, el volumen de inyección puede ser minimizado con la extracción cuidadosa del sobrenadante en el paso 5.3.6.3. Si se retira el sobrenadante hasta el nivel de los islotes sedimentado, normalmente hay más que suficiente espacio en la bolsa subcapsular a cabo 400 a 500 islotes. Sin embargo, si el volumen de inyección es demasiado grande, los islotes son más propensos a fugas de la bolsa durante el proceso de trasplante, poniendo en peligro la reproducibilidad del experimento.

Dentro de este protocolo, es posible modificar algunos de los pasos y aún así lograr resultados satisfactorios. Estos incluyen los siguientes: (a) el uso de una enzima diferente para digerir el páncreas, (b) un método diferente para la entrega de la enzima en el páncreas, (c) el uso de un continuo de Ficoll-diatrizoato de sodio (FSD) gradiente en lugar de la densidad de un solo paso Histopaque1077, y (d) trasplante de islotes a otros lugares de la subcapsule riñón.

  1. En este protocolo, Liberase se utiliza para debilitar a los contactos célula-célula en el páncreas. Liberase es esencialmente una mezcla altamente purificada de colagenasas que han demostrado ser útiles en la liberación de los islotes del páncreas. No obstante, las colagenasas menos purificada son capaces de lograr un resultado similar. Por lo tanto, es posible utilizar diferentes preparados enzimáticos disponibles en el mercado para digerir el páncreas, siempre y cuando la condición de la digestión se ha optimizado para conseguir una calidad de islotes de alta, el rendimiento y la pureza.
  2. También es posible para digerir el páncreas sin perfusión ductal de la enzima. La entrega de Liberase través del conducto biliar común permite una máxima exposición de la zona del páncreas superficie de la enzima. Esto da como resultado una digestión más aún del páncreas y una mayor liberación de los islotes intactos. Sin embargo, otras medidas para aumentar la superficie del páncreas para que la enzima se puede utilizar. Por ejemplo, picado el páncreas antes de incubar en Liberase o la inyección directa de Liberase través de la cápsula del páncreas puede ser usado para aislar los islotes. Sin embargo, ningún otro método de entrega Liberase es tan eficaz como la perfusión a través del conducto biliar común. Por lo tanto, la inyección de picado o directa debe reservarse como un último recurso, si el conducto biliar común está dañado y no perfusable.
  3. Un método alternativo para la separación de los islotes de las células exocrinas implica lael uso de un gradiente de FSD en lugar de Histopaque1077 10. La separación eficiente de los islotes de células exocrinas en este protocolo se debe en parte a un diferencial de densidad entre los dos tipos de células. Histopaque1077 tiene una densidad de 1,0771 g / ml a 25 ° C. A esta temperatura, Histopaque es más denso que los islotes, pero menos densa que las células exocrinas. Por lo tanto, bajo la fuerza de centrifugación, Histopaque1077 gránulos de las células exocrinas, levantando los islotes a la superficie. En principio, cualquier otra sustancia con una densidad que puede separar los islotes de células exocrinas se pueden utilizar en este paso y el gradiente de FSD es una de esas sustancias.
  4. Con respecto a la ubicación de los islotes del trasplante, la cápsula renal utilizados en este protocolo es uno de los pocos lugares posibles. Mientras que el subcapsule riñón es el sitio más frecuente de trasplante en ratones, el trasplante de otros sitios se han encontrado para ser eficaz y que incluyen la vena porta hepática, espacio subretiniano, testículos, almohadilla de grasa del epidídimo, el bazo, páncreas y hasta 11-14. Cada uno de estos lugares tiene sus propias ventajas y desafíos. Por lo tanto, la selección de un sitio para el trasplante de islotes debe ser determinado por las preguntas formuladas y las circunstancias específicas de los experimentos.

Se cree que las estrategias que se pueden superar las limitaciones en el trasplante de islotes dramáticamente mejorar su potencial terapéutico. Por lo tanto, el uso de un modelo murino que se detallan en este protocolo ofrece un enfoque atractivo para la identificación de tales estrategias.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por RO1 DK064938 (de TH).

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 31800-022
Liberase TL Reagent Roche Group 05401020001
Fetal Bovine Serum Reagent GIBCO, by Life Technologies 10437-028
Histopaque1077 Reagent Sigma-Aldrich 10771
Penicillin Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140
Sodium Citrate Reagent Sigma-Aldrich S4641
Streptozotocin Reagent Sigma-Aldrich S-0130
HCl Reagent Fisher Scientific A144-212
Isoflurane Reagent Vedco, Inc. ISOSOL
Glass Capillary Tubes Equipment Fisher Scientific 22362574
Insulin Syringe Equipment BD Biosciences 329461
27 Gauge Syringe Needle Equipment BD Biosciences 305109
Hamilton Syringe #1702 Equipment Fisher Scientific 14813133
10cm Petri Plates Equipment Fisher Scientific 0875712
6cm Petri Plates Equipment Fisher Scientific 07770212
6-0 Suture Equipment Ethicon Inc. 8726H
PE 50 Flexible Tubing Equipment Fisher Scientific NC9083963
5ml Disposable Syringe Equipment BD Biosciences 309603
50ml Conical Tube Equipment BD Biosciences 352098
15ml Conical Tube Equipment BD Biosciences 352097
0.1mm Nylon Mesh Equipment Fisher Scientific 22363549
0.419mm Wire Mesh Equipment Newark Wire Cloth Company 0300241
Water Bath Incubator Equipment Fisher Scientific 15-462-5
Dissecting Microscope Equipment Carl Zeiss, Inc. Stemi SV6
Inverted Microscope Equipment Nikon Instruments TMS
Tissue Culture Incubator Equipment Napco 6300
Dissecting Scissors Equipment Kent Scientific INS14393
McPherson-Vannas Scissors Equipment Kent Scientific INS500260
Curved Forceps Equipment Kent Scientific INS15915
Hemostatic Forceps Equipment Kent Scientific INS 500451
Isoflurane Nebulizer Equipment Smiths Medical ISOTech 4 OHMEDA
Swing Bucket Centrifuge Equipment Dupont – Sorvall RT6000D
Swing Bucket Rotor Equipment Dupont – Sorvall H1000B
pH Meter Equipment Mettler Toledo 09313509
Gel Loading Tips Equipment Fisher Scientific 05408151
p200 Tips Equipment USA Scientific, Inc. 111-0730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular
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Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. … More

Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096, doi:10.3791/2096 (2011).

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