Summary
Для развития РНК-интерференция (RNAi)-терапии на основе, новая стратегия была разработана, transkingdom RNAi (tkRNAi). Эта технология использует непатогенных бактерий производить и доставлять терапевтические короткие шпильки РНК (shRNA) в клетки-мишени. Здесь tkRNAi был успешно применен для разворота классической ABCB1-опосредованной множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) раковых клеток.
Abstract
РНК-интерференция (RNAi) представляет собой высокий эффективный механизм для специфического ингибирования экспрессии мРНК. Кроме того его потенциал в качестве мощного инструмента лаборатории, путем РНК-интерференции, кажется, перспективных для использования в терапевтических использования. Для развития РНК-интерференция (RNAi)-терапии на базе, доставка RNAi-посреднических агентов к клеткам-мишеням является одним из основных препятствий. Новая стратегия для преодоления этого препятствия является transkingdom RNAi (ТК RNAi). Эта технология использует непатогенные бактерии, например, кишечная палочка, производить и доставлять терапевтические короткие шпильки РНК (shRNA) в клетки-мишени, чтобы побудить RNAi. Первого поколения, т.к. RNAi-посреднической вектор, TRIP, содержит промотор бактериофага Т7 для регуляции экспрессии терапевтического shRNA интересов. Кроме того, поездка Инв локус от псевдотуберкулеза Yersinia, который кодирует invasin, что позволяет природного неинвазивной бактерии войти β1-интегрин-положительных клеток млекопитающих и ген HlyA от Listeria моноцитогенес, который производит listeriolysin О. Этот фермент позволяет терапевтических shRNA вырваться из вступления пузырьков в цитоплазме клетки-мишени. TRIP конструкции вводятся в компетентные непатогенных кишечной палочки штамма, который кодирует РНК-полимеразы Т7 необходимые для Т7 промотор-приводом синтез shRNAs. Хорошо характеризуется рак связаны молекулы-мишени для различных стратегий RNAi является ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Это ABC-транспортер действует как насос наркотиков экструзии и посредником "классической" ABCB1-опосредованной множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) фенотип человеческих раковых клеток, которое характеризуется определенной схеме сопротивление крест. Различные ABCB1-клеток, экспрессирующих MDR рака лечили с анти-ABCB1 shRNA вектор экспрессии подшипников Е. палочки. Эта процедура привела к активации пути RNAi в раковые клетки и значительное вниз регулирования ABCB1 кодирования мРНК, а также соответствующий насос экструзии препарата. Таким образом, кумуляция препарата была повышена в нетронутых лекарственной устойчивостью раковых клеток и фенотипом МЛУ было отменено. С помощью этой модели данных предоставляют доказательства правильности концепции, что т.к. RNAi подходит для модуляции рак сопутствующих факторов, например ABCB1, в человеческих раковых клеток.
Protocol
1) Бактериальные Доставка shRNAs
- Перед тем как начать с бактериальной культурой, надо подготовить LB-средой и LB-агар.
- Для LB-средой отвешивать дрожжевой экстракт (0,5% м / о), Бакто триптон (1,0% м / о) и NaCl (0,6% м / о) и разбавить эти компоненты в царской bidest. Подготовлены решения должны быть стерилизованы в автоклаве, а затем готовых к использованию.
- Для LB-агаром Бакто агар (1,5% м / о) должна быть добавлена к LB-среды до стерилизации.
- Нагрейте LB-агар в микроволновой печи до LB-агар полностью не растворится. Пусть решение остыть до бутылки могут быть затронуты легко, без получения ожогов. Добавить канамицин (100 мг / мл) для выбора положительных клонов в дальнейших шагах.
- Подготовка LB-агаром на скамейке ламинарного потока (стерильных условиях) с помощью пипетки 20 мл LB-агар раствора в 10-см чашках Петри. Пусть пластины остыть, пока жидкость стала твердой. Пластины готов к работе и может храниться при температуре 4 ° C.
- ShRNA-кодирования векторов экспрессии превращаются в компетентные E. кишечной ceq221 от теплового шока использованием CaCl 2 процедуры.
- Пластина преобразован бактерий на LB-агаром, содержащим 100 мкг / мл канамицина, закройте крышку, печать пластин с парафильмом и культивировать с ног на голову на 37 ° C в течение ночи.
- Привить бактериальных культур с мини-положительных клонов, выбирая выросших колоний с зубом выбор. Передача зуб забрать в 7,0 мл свежей LB-среде, содержащей 100 мг / мл канамицина и культивируют при 37 ° С в течение ночи на качалке при 200 оборотах в минуту.
- Инокуляции 100 мл свежей LB-среде, содержащей 100 мг / мл канамицина 1:100 с в течение ночи мини культуры в 1 л колбе Эрленмейера, и инкубировать при 37 ° С в течение ночи на качалке при 200 оборотах в минуту.
- Семенной 25 х 10 4 (количество клеток посеяны зависит от скорости роста клеток в соответствии клеточной линии; слияния должна быть ~ 70-80% через 24 часа после посева) желудка человека клетки карциномы (EPG85-257RDB) на лунку в 6 - также блюда и инкубировать их при 37 ° С, в 5% CO 2, водяной пар насыщенной атмосфере в течение ночи.
- Предыдущая к раку инфекции клетки, в течение ночи культур т.к. RNAi вектор-содержащее Е. кишечной измеряются в фотометр для определения OD 600. Развести бактериального раствора до оптической плотности 0,5 достигается (OD 600 = 0,5 равна 1,6 х 10 8 бактериальных клеток / мл).
- Замените FCS-содержащих клеточных культуральной среды клеток карциномы против ФТС среде без 30 минут до бактериальных совместной инкубации.
- Вымойте бактерий в два раза с 1 х PBS, и развести в бессывороточной Лейбовиц L-15 среды.
- Добавить разбавленный бактерий к раковым клеткам на желаемом МВД (множественность заражения = количество бактериальных клеток в раковые клетки) и со-инкубации бактерий и раковых клеток в течение 2 часов при температуре 37 ° C.
- После 2 часов совместной инкубации клеток рака дважды промывали PBS 1x х и один раз с сывороткой содержащих Лейбовиц L-15 среде, дополненной 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина, 150 мкг / мл гентамицина и 100 мкг / мл канамицина.
- Продолжить культивирование раковых клеток при 37 ° С, в 5% CO 2, водяной пар насыщенной атмосфере.
- Эффекты лечения бактериального могут быть визуализированы методом флуоресцентной микроскопии, измеряется количественными реальном времени ПЦР на уровне мРНК, а к западной блот-анализа на уровне белка, а также показаны функциональные тесты, как FACS анализ и анализы клеточной пролиферации. (При желании, эти процедуры могут быть описаны подробно).
2) Результаты представитель
Если протокол выполняется правильно, результаты должны быть сопоставимы с теми, показано ниже.
Люминесцентной микроскопии
На рисунке 1 показана желудка человека рак через три часа после лечения бактериального () по сравнению с необработанной клетки (б). Вокруг ядра обработанной клетки, бактерии могут быть обнаружены.
Рисунок 1: флуоресцентная микроскопия правам рак желудка после лечения бактериального (1:500) и необработанные желудка человека рак, как контроль, DAPI-окрашивание, DAPI полосовой фильтр (Λem = 640 нм), 40x цели.
Количественные в режиме реального времени RT PCR
На рисунке 2 вниз регулирования MDR1 мРНК около 70% (черный луч) можно увидеть после лечения терапевтических бактерий. Родительские клетки служат в качестве положительного контроля из-за отсутствия MDR1 гиперэкспрессия. Клеточная линия 257RDB p170 содержащие плазмиды выражения анти-MDR1 shRNAs ы рассматривать как прямое сравнение технологий transkingdom RNAi другим RNAi глушителей стратегий. Необработанной устойчивые линии клеток EPG85-257RDB гиперэкспрессией MDR1, те же линии клеток обработанных бактерий не хватает shRNA выражения плазмиды, и эта линия клеток получавших терапевтические бактерионосительства плазмиды выражения анти-MRP2 shRNAs были взяты в качестве положительного контроля.
Рисунок 2: Количественный реальном времени ПЦР MDR1 мРНК после лечения терапевтических Е. кишечной ceq221 выражения анти-MDR1 shRNAs (МВД 1: 500). Нормализация проводили с использованием альдолаза хозяйства гена. MDR1/aldolase соотношение необработанных клетках клеточная линия EPG85-257RDB были установлены на 100%. P-значения были рассчитаны с использованием Стьюдента-тест (* = р <0,05, ** = р <0,005, *** = р <0,001).
Вестерн-блот анализа
Рисунок 3 показывает, что MDR1 вниз регулирования также состоялся белка после лечения бактериального. Он показывает не хватает MDR1 выражение наркотиков чувствительной исходной клеточной линии (EPG85-257P), MDR1 выражение необработанной лекарственной устойчивостью клеточной линии (EPG85-257RDB) и MDR1 выражение рассматривается образца. Ясно вниз регулирования MDR1 из бактериально обработанных клеток можно наблюдать. 
Рисунок 3: Вестерн-блот анализе MDR1 уровни экспрессии необработанной лекарственной чувствительностью EPG85-257P, необработанной лекарственной устойчивостью EPG-257RDB, и EPG85-257RDB после совместной инкубации с E.. кишечной ceq221 + p43 MDR1. Первичная Ab C219 1:100, и анти-актина 1:5 000, среднее Ab антимышиным 1:10 000.
Цитотоксичность анализа
Функциональный анализ как цитотоксичности анализа показано на рисунке 4 также показатели функционирования transkingdom RNAi. Исходной клеточной линии и линии клеток содержащих anit-MDR1 shRNA выражения плазмиды не проявляют устойчивость к даунорубицин. Устойчивые линии клеток EPG85-257RDB и еще два управления не показывают значительных изменений в сопротивление по сравнению с образцом получавших анти-MDR1 shRNA выражения бактерий, где сопротивление Даунорубицин может быть отменено около 90%.
Рисунок 4: Цитотоксичность анализа. Лекарственно-IC50 конкретных значений определяется цитотоксичность тест для выживаемости клеток. P-значения были рассчитаны с использованием Стьюдента-тест (* = р <0,05, ** = р <0,005, *** = р <0,001).
Антрациклиновые накопления анализа
По данным снижен сопротивление бактериально обработанных образцов (рис. 4), антрациклины накопления анти-MDR1 shRNA обработанных клеток увеличивается примерно на 90%, как показано на рисунке 5. Исходной клеточной линии и линии клеток 257RDB p170 показать сильные даунорубицин накопление до 100%. Устойчивый вариант показывает, редко какой-либо накопления. Клетках, обработанных анти-MDR1 shRNA выражения бактерий показать anthracyline увеличение накопления 90%.
Рисунок 5: Антрациклиновые накопления анализа. Антрациклиновые накопление клеток карциномы 6 дней после лечения бактериального измеряется с помощью проточной цитометрии. P-значения были рассчитаны с использованием Стьюдента-тест (* = р <0,05, ** = р <0,005, *** = р <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Номер ячейки отобранный для инфекции и соответствующие МВД использовали, критически зависят от клеточных линий под наблюдением и их скорость роста. Чтобы найти оптимальное количества клеток для посева, предварительно экспериментов, чтобы определить скорость роста настоятельно рекомендуется. Кроме того, различные Mois должны быть проверены из-за ограниченного распространяется на которой клетки могут стоять бактериальной инвазии, не умирая от стресса. Оптимальной точке времени, когда вниз регулирования гена под наблюдением может варьироваться. Рекомендуется проводить эксперименты в течение определенного периода времени, чтобы найти оптимальные условия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке гранта нет. 01GU0615 из "Bundesministerium für Forschung унд Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
