Summary
RNA干渉（RNAi）ベースの治療法の開発のための、新たな戦略が開発された、transkingdomのRNAi（tkRNAi）。この技術は、生産し、標的細胞への治療短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を提供する非病原性細菌を使用しています。ここで、tkRNAiが正常に癌細胞の古典的なABCB1を介した多剤耐性（MDR）の反転を適用した。
Abstract
RNA干渉（RNAi）は、mRNA発現の特異的阻害のための高い効果的なメカニズムを表します。強力な実験ツールとしての可能性に加えて、RNAi経路は、治療の利用のために有望なように見えます。 RNA干渉（RNAi）ベースの治療法の開発のため、標的細胞へのRNAiを媒介剤の送達は、大きな障害の一つです。このハードルを克服する新たな戦略は、transkingdomのRNAi（RNA干渉TK）です。この技術は、生産し、RNAiを誘導する標的細胞への治療短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を提供するために、非病原性の細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）を使用しています。第一世代のTK RNAiを媒介ベクトル、TRIPは、関心の治療shRNAの発現調節のためのバクテリオファージT7プロモーターが含まれています。また、TRIPは、この酵素listeriolysin Oを生成するリステリア菌からβ1-インテグリン陽性哺乳類細胞とHlyAの遺伝子を、入力するように自然な非侵襲的な細菌を許可するインベイシンをコードエルシニア偽結核からInv遺伝子座を、持って治療したshRNAがから脱出することができますエントリは、標的細胞の細胞質内小胞。 TRIPコンストラクトはshRNAのT7プロモータードリブン合成に必要なT7 RNAポリメラーゼをコードして有能な非病原性大腸菌の菌株に導入されています。異なるRNAiの戦略のための十分に特徴付けられた癌関連標的分子は、ABCB1（MDR1/P-glycoprotein、MDR1/P-gp）です。薬剤の押し出しポンプとを仲介する"古典的"ABCB1を介した多剤耐性（MDR）特定の交差抵抗性パターンによって特徴付けられるヒト癌細胞の表現型としてこのABCトランスポーターの役割を果たします。異なるABCB1発現MDR癌細胞を抗ABCB1 shRNAの発現ベクターベアリングE.で処理した大腸菌 。この手順では、がん細胞とABCB1コードmRNAと同様に対応する薬剤の押し出しポンプのかなりのダウンレギュレーション内のRNAi経路の活性化をもたらした。したがって、薬物の蓄積は、原始的な薬剤耐性癌細胞で強化され、MDRの表現型を逆転した。このモデルにより、データはtkの RNAiがヒト癌細胞における癌関連因子、例えば、ABCB1、の変調に適していることが証明の概念を提供しています。
Protocol
shRNAの1）細菌配達
- 細菌培養を開始する前に、一つはLB -培地およびLB -寒天を準備する必要があります。
- LB -培地は、酵母エキス（0.5％w / v）の、バクトトリプトン（1.0％w / v）を、およびNaCl（0.6％w / v）の検量するとアクアbidestでこれらのコンポーネントを希釈するため。調製された溶液は、オートクレーブで滅菌する必要がありますし、使用する準備が整いました。
- LB -寒天プレート用バクト寒天（1.5％w / v）を滅菌する前のLB -培地に添加する必要があります。
- LB -寒天が完全に溶解するまで電子レンジでLB -寒天を加熱する。ボトルが火傷することなく簡単に触れることができるまで溶液が冷却させます。さらなるステップで陽性クローンの選択のためのカナマイシン（100 mg / mL）を追加します。
- 10cmのペトリ皿にLB -寒天溶液20mlをピペッティングすることにより、層流ベンチ（無菌状態）でLB -寒天プレートを準備します。液体が固体になるまでのプレートが冷却させます。プレートは使用可能になりますし、4℃で保存することができます。
- shRNAをコードする発現ベクターはコンピテント大腸菌に変換されますCaCl 2の手順を使用して、熱ショックにより大腸菌 ceq221。
- 板100μg/ mlのカナマイシンを含むLB -寒天プレート上で形質転換された細菌は、、蓋を閉じてパラフィルムでプレートをシールし、℃で一晩37℃で逆さまに栽培しています。
- 歯のピックで生育したコロニーを選択することにより陽性クローンを持つ細菌のミニ培養を接種する。歯が100 mg / mlのカナマイシンおよび° C一晩200 rpmで振とう機で37℃で栽培を含む新鮮なLB -培地の7.0 mlにピックアップ移す。
- 1リットルの三角フラスコに一晩ミニカルチャー、100 mg / mlのカナマイシン1:100を含むLB -培地新鮮な100mlを植菌し、200rpmで° C一晩シェーカー上で37インキュベートする。
- シード25 × 10 4、6のウェル当たりヒト胃癌細胞（EPG85 - 257RDB）（播種した細胞の数に従って、細胞株の細胞増殖の速度に依存する細胞集密度は24時間播種後〜70から80パーセントにする必要があります） -よく料理し、37これらをインキュベート℃、一晩5％CO 2、水蒸気飽和雰囲気インチ
- TKのRNAiベクターを含有E.の夜の文化上、癌細胞の感染の前大腸菌は、OD 600を決定するために光度計で測定されています。 0.5の光学密度まで、菌液を希釈する（OD 600 = 0.5は1.6 × 10 8細菌細胞/ mlに等しい）に達している。
- FCSを含まない培地の共同インキュベーション細菌へ前の30分に対して、癌細胞のFCSを含む細胞培養培地を交換してください。
- 1 × PBSで2回細菌を洗浄し、無血清リーボビッツL - 15培地で希釈する。
- 37℃で2時間ガン希望のMOIで細胞（癌細胞あたりの細菌細胞の感染多重度は=数）と共同インキュベーション細菌やがん細胞に希釈した細菌を追加℃を
- 共同インキュベーションの癌細胞の2時間は、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2.5μg/ mlのアンホテリシン、150μgの/を添加した血清含有リーボビッツL - 15培地で1回1 × X PBSで2回洗浄し、された後にミリリットルゲンタマイシン、および100μg/ mlのカナマイシン。
- 37℃で癌細胞を培養° Cを、5％CO 2、水蒸気飽和雰囲気の中で継続する。
- 細菌治療の効果は、mRNAレベルで定量的リアルタイムRT PCRによって測定された蛍光顕微鏡、、でおよびタンパク質レベルでのウェスタンブロット解析によって視覚化、およびFACS分析、および細胞増殖アッセイのような機能的アッセイで表示できます。 （したい場合は、これらの手順を詳細に説明することができます）。
2）代表者の結果
プロトコルが正しく行われている場合、結果は以下に示すものと同等でなければなりません。
蛍光顕微鏡
図1は、三時間細菌の治療後のヒト胃癌細胞を（）未処理細胞（B）と比較して示しています。処理した細胞の核の周りに、細菌を検出することができます。
図1：細菌の治療（1:500）の後に蛍光顕微鏡でヒト胃癌細胞と未処理ヒト胃癌細胞制御として、DAPI染色、DAPIバンドパスフィルタ（Λemは= 640 nm）を、40倍目標。
定量的リアルタイムRT PCR
図2では約70％（黒線）のMDR1 mRNAのダウンレギュレーションは、治療上の細菌による治療後に見ることができます。親細胞はMDR1の過剰発現の欠如に起因するポジティブコントロールとして使用。細胞株を発現するプラスミド抗MDR1したshRNAの他のRへtranskingdomのRNAi技術の直接比較として撮影を含む257RDB p170NAIは、戦略をサイレンシング。未治療耐性細胞株EPG85 - 257RDB過剰発現するMDR1、発現するプラスミドshRNAを欠いている細菌で処理同じ細胞株、およびこの細胞株を発現するプラスミド抗MRP2 shRNAを運ぶの治療細菌による治療は、陽性対照として採用した。
図2：治療E.治療後の定量的リアルタイムRT PCR MDR1 mRNA発現抗MDR1 shRNAを（：500 MOI 1）を発現する大腸菌 ceq221。正規化は、ハウスキーピング遺伝子のアルドラーゼを用いて行った。細胞株EPG85 - 257RDBの未処理の細胞のMDR1/aldolase比率が100％に設定されていました。 P -値はスチューデントのt検定を使用して計算された（* = p <0.05、** = P <0.005、*** = p <0.001）。
ウェスタンブロット分析
図3は、ダウンレギュレーションMDR1も細菌の治療後のタンパク質レベルで行われたことがわかります。それは、薬剤に敏感な親細胞系（EPG85 - 257P）、未治療の薬剤耐性細胞株（EPG85 - 257RDB）のMDR1の発現と処理されたサンプルのMDR1発現の欠けているMDR1の発現を示しています。バクテリア処理した細胞のMDR1の明確なダウンレギュレーションが観察することができます。 
図3：ウエスタンブロット分析の未治療の薬剤感受性EPG85 - 257PのMDR1発現レベル、E.との共同インキュベーション後の未治療の薬剤耐性EPG - 257RDB、およびEPG85 - 257RDBの。 大腸菌 ceq221 + P43 MDR1。一次抗体C219 1:100、及び抗アクチン1時05分000、二次抗体抗マウス1:10000。
細胞毒性分析
図4に示すように細胞毒性アッセイのような機能解析もtranskingdom RNAiの機能のための指標です。親細胞株とを発現するプラスミドANIT - MDR1 shRNAを含む細胞株は、ダウノルビシンへの抵抗性を示していない。耐性細胞株EPG85 - 257RDBと、さらに2つのコントロールは、ダウノルビシンに対する抵抗が約90％で逆転することができる抗MDR1 shRNAを発現している細菌で処理された試料に比べて抵抗値の有意な変化を示していない。
図4：細胞毒性アッセイ。薬剤特異的細胞の生存のための細胞毒性アッセイによって決定されたIC50 -値。 P -値はスチューデントのt検定を使用して計算された（* = p <0.05、** = P <0.005、*** = p <0.001）。
アントラサイクリン系薬剤の蓄積アッセイ
図5に示すように、バクテリア処理した試料の抵抗力低下（図4）によると、抗MDR1 shRNAを処理した細胞のアントラサイクリン蓄積が約90％増加しています。親細胞系と細胞株257RDB p170は100％に強いダウノルビシン蓄積を示す。耐性変異株はほとんどあらゆる蓄積を示していない。抗MDR1 shRNAを発現している細菌で処理した細胞は90％のanthracyline蓄積の増加を示す。
図5：アントラサイクリン蓄積アッセイ。 6日間をフローサイトメトリーで測定した細菌の治療後の癌細胞のアントラサイクリン蓄積。 P -値はスチューデントのt検定を使用して計算された（* = p <0.05、** = P <0.005、*** = p <0.001）。
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Discussion
使用される感染症とそれに対応するMOIための播種細胞数は、批判的に細胞観察の下に線との成長の速度に依存する。シードに最適な細胞数を検索するには、事前に実験の成長の速度を決定することが強く推奨されています。このほかに、別の湿気が原因で細胞がストレスで死ぬことなく、細菌の侵入に耐えることができるためにどの拡張限定にテストする必要があります。観察下にある遺伝子のダウンレギュレーションが異なる場合があります時間の最適なポイント。それは最適な条件を見つけるために一定期間にわたって実験を行うことをお勧めします。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
作業は、助成金なしでサポートされていました。 "BundesministeriumこだわりForschungウントTechnologie（BMBF）の01GU0615。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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