Summary
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) आधारित चिकित्सा के विकास के लिए, एक उपन्यास की रणनीति विकसित की है, transkingdom आरएनएआई (tkRNAi). इस तकनीक गैर रोगजनक बैक्टीरिया का उपयोग करता है उत्पादन और लक्ष्य कोशिकाओं में चिकित्सीय कम बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) देने. यहाँ, tkRNAi शास्त्रीय ABCB1 की मध्यस्थता कैंसर कोशिकाओं के बहुऔषध प्रतिरोध (एमडीआर) के उत्क्रमण के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था.
Protocol
1) shRNAs बैक्टीरियल डिलिवरी
- बैक्टीरियल संस्कृति के साथ शुरू करने से पहले, एक लेग मध्यम और लेग बाइ अगर तैयार है.
- के लिए लेग मध्यम खमीर (0.5% w / ध्) निकालने, bacto tryptone (1.0% w / v), और NaCl (0.6% w / ध्) वजन और एक्वा bidest में इन घटकों को कमजोर. एक autoclave में निष्फल हो तैयार समाधान है और उसके बाद का उपयोग करने के लिए तैयार हैं.
- लेग बाइ अगर प्लेटों के लिए bacto (1.5% w / v) अगर नसबंदी के लिए पिछले लेग मध्यम करने के लिए जोड़ा जा है.
- माइक्रोवेव में लेग बाइ अगर हीट जब तक लेग बाइ अगर पूरी तरह भंग है. चलो समाधान शांत जब तक बोतल जला दिया हो रही बिना किया जा आसानी से छुआ जा सकता है. आगे के चरणों में सकारात्मक क्लोन के चयन के लिए kanamycin जोड़ें (100 मिलीग्राम / एमएल).
- एक लामिना का प्रवाह बेंच (बाँझ शर्तों) में 10 सेमी पेट्री - व्यंजन में लेग बाइ अगर समाधान के 20 मिलीलीटर pipetting द्वारा लेग - अगर प्लेटों की तैयारी. चलो प्लेटें शांत जब तक तरल पदार्थ ठोस बन गया है. प्लेटें अब कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए तैयार हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- ShRNA एन्कोडिंग अभिव्यक्ति वैक्टर सक्षम ई. में तब्दील कर रहे हैं CaCl 2 प्रक्रिया का उपयोग कर गर्मी सदमे द्वारा ceq221 कोलाई.
- प्लेट लेग बाइ अगर 100 μg / मिलीलीटर kanamycin युक्त प्लेटों पर बैक्टीरिया तब्दील, ढक्कन बंद, parafilm के साथ प्लेटें मुहर और 37 पर उल्टा खेती रात से अधिक डिग्री सेल्सियस.
- एक दांत लेने के साथ हो कालोनियों उठा द्वारा सकारात्मक क्लोन के साथ जीवाणु मिनी संस्कृतियों का टीका लगाना. ताजा लेग 100 मिलीग्राम / एमएल kanamycin और 200 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर डिग्री सेल्सियस रात खत्म 37 पर खेती युक्त मध्यम की 7.0 मिलीलीटर में दांत लेने के स्थानांतरण.
- 100 मिलीलीटर टीका लगाना ताजा LB मध्यम 1 एल Erlenmeyer फ्लास्क में रात मिनी संस्कृति, और सेते के साथ 100 मिलीग्राम / एमएल kanamycin 1:100 200 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस रात खत्म पर युक्त.
- 25 बीज 4 x 10; मानव अच्छी तरह से प्रति गैस्ट्रिक कार्सिनोमा (EPG85 257RDB) 6 में कोशिकाओं (वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के अनुसार सेल लाइन के सेल के विकास की गति पर निर्भर करता है confluency ~ बोने के बाद 24 घंटे के 70-80% होना चाहिए) अच्छी तरह से व्यंजन और 37 में इन सेते डिग्री सेल्सियस, एक 5% सीओ 2, रात खत्म जल वाष्प संतृप्त माहौल में.
- कैंसर कोशिका संक्रमण के लिए पिछला, tk आरएनएआई वेक्टर युक्त ई. की रात संस्कृतियों पर कोलाई 600 आयुध डिपो निर्धारित photometer में मापा जाता है. 0.5 की एक ऑप्टिकल घनत्व तक बैक्टीरियल समाधान पतला (600 आयुध डिपो 0.5 = 1.6 x 10 8 बैक्टीरियल कोशिकाओं / एमएल के बराबर होती है) तक पहुँच जाता है.
- FCS मुक्त मध्यम 30 बैक्टीरियल सह - ऊष्मायन पिछले मिनट के खिलाफ कार्सिनोमा कोशिकाओं के सेल युक्त FCS संस्कृति के माध्यम बदलें.
- बैक्टीरिया x 1 पीबीएस के साथ दो बार, धो और सीरम मुक्त लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम में जलमिश्रित.
- वांछित MOI में कैंसर की कोशिकाओं (संक्रमण की बहुलता कैंसर सेल प्रति बैक्टीरियल कोशिकाओं की संख्या =) और सह सेते बैक्टीरिया और 37 पर 2 घंटे के लिए कैंसर की कोशिकाओं को पतला बैक्टीरिया जोड़ें डिग्री सेल्सियस
- सह ऊष्मायन कैंसर की कोशिकाओं के 2 घंटे के बाद दो बार 1x एक्स पीबीएस के साथ धोया गया और एक बार सीरम युक्त लेबोविट्ज़ एल 15 के साथ 100 / u मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2.5 μg / एमएल amphotericin, 150 μg / पूरक मध्यम के साथ मिलीलीटर gentamicin, और 100 μg / मिलीलीटर kanamycin.
- 37 में कैंसर की कोशिकाओं की खेती ° सी, एक 5% 2 सीओ, जल वाष्प संतृप्त माहौल में जारी रखें.
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, mRNA स्तर पर मात्रात्मक वास्तविक समय RT पीसीआर द्वारा मापा, और प्रोटीन के स्तर पर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा जीवाणु उपचार के प्रभाव visualized किया, और कर सकते हैं FACS, विश्लेषण, और सेल प्रसार assays की तरह कार्यात्मक assays के साथ दिखाया गया है. (अगर चाहता था, इन प्रक्रियाओं के विस्तार में वर्णित किया जा सकता है है).
2) प्रतिनिधि परिणाम
यदि प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है, परिणाम नीचे दिखाया गया हैं करने के लिए तुलनीय होना चाहिए.
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
चित्रा 1 में एक मानव जीवाणु उपचार के बाद तीन घंटे गैस्ट्रिक कार्सिनोमा सेल () एक अनुपचारित सेल (ख) की तुलना में दिखाता है. इलाज सेल के नाभिक के चारों ओर, जीवाणु पाया जा सकता है.
चित्रा 1: बैक्टीरियल उपचार (1:500) के बाद प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोपी मानव गैस्ट्रिक कार्सिनोमा सेल और एक अनुपचारित मानव गैस्ट्रिक कार्सिनोमा नियंत्रण के रूप में सेल, DAPI धुंधला हो जाना, DAPI bandpass फिल्टर (Λem = 640 एनएम), 40x उद्देश्य .
मात्रात्मक वास्तविक समय RT पीसीआर
आंकड़ा 2 MDR1 mRNA की के बारे में 70% की एक नीचे विनियमन (काला बीम) चिकित्सीय बैक्टीरिया के साथ उपचार के बाद देखा जा सकता है. माता - पिता कोशिकाओं MDR1 overexpression की कमी के कारण एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. सेल लाइन p170 257RDB युक्त एक प्लाज्मिड व्यक्त विरोधी MDR1 shRNAs अन्य आर transkingdom आरएनएआई प्रौद्योगिकी के प्रत्यक्ष तुलना के रूप में लियानई रणनीतियों मुंह बंद. इलाज प्रतिरोधी सेल लाइन EPG85 257RDB MDR1 overexpressing, एक ही सेल लाइन प्लाज्मिड व्यक्त shRNA कमी जीवाणु के साथ इलाज है, और इस सेल लाइन चिकित्सीय एक प्लाज्मिड व्यक्त विरोधी MRP2 shRNAs ले जाने के जीवाणु के साथ इलाज सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ले जाया गया.
चित्रा 2: मात्रात्मक वास्तविक समय RT चिकित्सकीय ई. के साथ उपचार के बाद पीसीआर MDR1 mRNA अभिव्यक्ति ceq221 कोलाई विरोधी MDR1 shRNAs (1 MOI: 500) को व्यक्त . सामान्य गृह व्यवस्था जीन aldolase का उपयोग किया था. सेल लाइन EPG85 257RDB के इलाज कोशिकाओं के MDR1/aldolase अनुपात 100% निर्धारित किया गया. पी मान छात्र टी परीक्षण उपयोग कर की गणना थे (* = पी <0.05, ** = पी <0.005, *** = 0.001 <पी).
पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
चित्रा 3 से पता चलता है कि विनियमन नीचे MDR1 भी जीवाणु उपचार के बाद प्रोटीन के स्तर पर जगह ले ली. यह संवेदनशील दवा पैतृक सेल लाइन (EPG85-257P), इलाज दवा प्रतिरोधी सेल लाइन (EPG85 257RDB) के MDR1 अभिव्यक्ति और इलाज के नमूने के MDR1 अभिव्यक्ति की कमी MDR1 अभिव्यक्ति से पता चलता है. Bacterially इलाज किया कोशिकाओं का एक स्पष्ट MDR1 के नीचे विनियमन मनाया जा सकता है. 
चित्रा 3: पश्चिमी धब्बा विश्लेषण MDR1 इलाज दवा के प्रति संवेदनशील EPG85-257P की अभिव्यक्ति के स्तर, इलाज दवा प्रतिरोधी EPG 257RDB, और EPG85 - 257RDB के ई. के साथ सह - ऊष्मायन के बाद . ceq221 कोलाई + MDR1 P43. प्राथमिक C219 अब 1:100, और विरोधी actin 01:05 000, माध्यमिक अब विरोधी माउस 01:10 000.
Cytotoxicity परख
आंकड़ा 4 में दिखाया cytotoxicity परख तरह कार्यात्मक विश्लेषण भी transkingdom आरएनएआई के कामकाज के लिए संकेतक हैं. पैतृक सेल लाइन और सेल लाइन युक्त एक anit-MDR1 प्लाज्मिड व्यक्त shRNA daunorubicin के लिए किसी भी प्रतिरोध नहीं दिखा है. प्रतिरोधी सेल लाइन EPG85 257RDB और दो नियंत्रण प्रतिरोध में महत्वपूर्ण परिवर्तन विरोधी MDR1 shRNA व्यक्त बैक्टीरिया जहां daunorubicin करने के लिए प्रतिरोध के बारे में 90% से उलट हो सकता है है के साथ इलाज के नमूने के लिए की तुलना में नहीं दिखा है.
चित्रा 4: cytotoxicity परख. औषध विशिष्ट सेल अस्तित्व के लिए एक cytotoxicity परख द्वारा निर्धारित IC50 मूल्यों. पी मान छात्र टी परीक्षण उपयोग कर की गणना थे (* = पी <0.05, ** = पी <0.005, *** = 0.001 <पी).
Anthracycline संचय परख
Bacterially इलाज के नमूने की कम प्रतिरोध (आंकड़ा 4) के अनुसार, विरोधी MDR1 shRNA इलाज किया कोशिकाओं की anthracycline संचय के बारे में 90% की वृद्धि हुई है के रूप में 5 आंकड़े में दिखाया. पैतृक सेल लाइन और सेल लाइन 257RDB p170 एक मजबूत daunorubicin संचय दिखाने के 100% करने के लिए. प्रतिरोधी संस्करण शायद ही कभी किसी भी संचय से पता चलता है. विरोधी MDR1 shRNA व्यक्त जीवाणु के साथ इलाज किया कोशिकाओं में 90% की एक anthracyline संचय वृद्धि दिखा.
चित्रा 5: anthracycline संचय परख. Anthracycline बैक्टीरियल प्रवाह cytometry द्वारा मापा इलाज के 6 दिन बाद कार्सिनोमा कोशिकाओं के संचय. पी मान छात्र टी परीक्षण उपयोग कर की गणना थे (* = पी <0.05, ** = पी <0.005, *** = 0.001 <पी).
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Discussion
सेल नंबर के संक्रमण के लिए वरीयता प्राप्त और इसी MOI इस्तेमाल किया, गंभीर अवलोकन के अंतर्गत सेल लाइनों और विकास की अपनी गति पर निर्भर है. बोने के लिए इष्टतम सेल नंबर मिल करने के लिए, विकास की गति निर्धारित करने के लिए पूर्व प्रयोगों पुरजोर सिफारिश की है. इस के अलावा, विभिन्न MOIs कारण सीमित परीक्षण किया जाना चाहिए जो कोशिकाओं को तनाव के मरने के बिना जीवाणु आक्रमण खड़े हो सकते हैं विस्तार. समय जहां निगरानी में जीन के नीचे विनियमन भिन्न हो सकते हैं का इष्टतम बिंदु. यह करने के लिए इष्टतम स्थितियों को खोजने के लिए समय की एक निश्चित अवधि में प्रयोगों प्रदर्शन करने की सिफारिश की है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
कार्य कोई अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. 01GU0615 "Bundesministerium फर Forschung und प्रौद्योगिकियों (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
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