Summary
Per lo sviluppo di RNA interference (RNAi) a base di terapie, una nuova strategia è stata sviluppata, transkingdom RNAi (tkRNAi). Questa tecnologia utilizza batteri non patogeni per produrre e consegnare terapeutici a breve hairpin RNA (shRNA) all'interno delle cellule bersaglio. Qui, tkRNAi stato applicato con successo per l'inversione del classico ABCB1-mediata multiresistenza ai farmaci (MDR) delle cellule tumorali.
Abstract
Interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta un meccanismo efficace per alto inibizione specifica di espressione di mRNA. Oltre alla sua potenzialità come strumento di laboratorio potente, il percorso RNAi sembra essere promettente per l'utilizzo terapeutico. Per lo sviluppo di RNA interference (RNAi) a base di terapie, la consegna di RNAi-mediare agli agenti di cellule bersaglio è uno dei principali ostacoli. Una nuova strategia per superare questo ostacolo è transkingdom RNAi (tk RNAi). Questa tecnologia utilizza batteri non patogeni, ad esempio, Escherichia coli, a produrre e consegnare terapeutici a breve hairpin RNA (shRNA) all'interno delle cellule bersaglio per indurre RNAi. Una prima generazione tk RNAi-mediare vettore, TRIP, contiene il promotore del batteriofago T7 per la regolazione della espressione di un shRNA terapeutiche di interesse. Inoltre, TRIP è il luogo Inv. da pseudotuberculosis Yersinia che codifica invasin, che permette di batteri naturali non invasivi per entrare β1-integrina-positivi cellule di mammifero e il gene HlyA da Listeria monocytogenes, che produce listeriolysin O. Questo enzima permette la shRNA terapeutico per sfuggire ingresso vescicole all'interno del citoplasma della cellula bersaglio. Costruisce TRIP sono introdotti in un competente non patogeni ceppo di Escherichia coli, che codifica per l'RNA polimerasi T7 necessari per il promotore T7-driven sintesi di shRNAs. A ben caratterizzato associata al cancro molecola bersaglio per le diverse strategie di RNAi è ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Questo-trasportatore ABC agisce come una pompa di estrusione di droga e la media "classici" ABCB1-mediata multiresistenza ai farmaci (MDR) fenotipo delle cellule tumorali umane che si caratterizza per un modello specifico resistenza crociata. Diverse ABCB1 che esprimono le cellule tumorali MDR sono stati trattati con anti-ABCB1 espressione vettore shRNA cuscinetto E. coli. Questa procedura ha determinato l'attivazione dei percorsi RNAi all'interno delle cellule tumorali e un regolamento notevole giù del mRNA ABCB1 codifica e la corrispondente pompa di estrusione droga. Di conseguenza, l'accumulazione della droga è stato migliorato nella incontaminata farmaco-resistenti le cellule tumorali e il fenotipo MDR è stata invertita. Per mezzo di questo modello i dati forniscono la proof-of-concept che tk RNAi è adatto per la modulazione di cancro associati fattori, ad esempio ABCB1, nelle cellule tumorali umane.
Protocol
1) Consegna batterica di shRNAs
- Prima di iniziare con la coltura batterica, si deve preparare LB-media e LB-agar.
- Per la LB-medio pesare estratto di lievito (0,5% w / v), bacto triptone (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluire questi componenti in acqua bidistillata. Le soluzioni preparate devono essere sterilizzati in autoclave e sono pronti per l'uso.
- Per LB-agar agar bacto (1,5% w / v) deve essere aggiunto al LB-medium precedente alla sterilizzazione.
- Riscaldare LB-agar nel forno a microonde fino a quando il LB-agar è completamente sciolto. Lasciar raffreddare la soluzione fino a quando la bottiglia può essere toccato con facilità senza bruciarsi. Aggiungi kanamicina (100 mg / ml) per la selezione di cloni positivi in fasi successive.
- Preparare LB-agar piastre a una panchina a flusso laminare (condizioni sterili) pipettando 20 ml di LB-agar soluzione in 10 cm di Petri-piatti. Lasciate raffreddare le piastre fino a quando il liquido è diventato solido. Le piastre sono ora pronti per l'uso e può essere conservato a 4 ° C.
- ShRNA-encoding vettori di espressione sono trasformati in competenti E. coli ceq221 da shock termico utilizzando la procedura di CaCl 2.
- Piastra i batteri trasformati su LB-agar in piastre contenenti 100 mg / ml kanamicina, chiudere il coperchio, sigillare le piastre con parafilm e coltivare a testa in giù a 37 ° C durante la notte.
- Inoculare batteri culture mini con cloni positivi con la scelta di colonie cresciute con uno stuzzicadenti. Trasferire il stuzzicadenti in 7,0 ml di fresca LB-mezzo contenente 100 mg / ml kanamicina e coltivare a 37 ° C durante la notte su un agitatore a 200 giri al minuto.
- Inoculare 100 ml di fresca LB-mezzo contenente 100 mg / ml kanamicina 1:100 con la cultura notte su mini in un pallone di Erlenmeyer l 1, e incubare a 37 ° C durante la notte su un agitatore a 200 giri al minuto.
- Semi di 25 x 10 4 (numero di cellule inseminate dipende dalla velocità di crescita delle cellule della linea cellulare secondo; confluenza dovrebbe essere il 70-80% ~ 24 ore dopo la semina) cellule umane di carcinoma gastrico (EPG85-257RDB) per bene in 6 - piatti bene e incubare questi a 37 ° C, in atmosfera al 5% di CO 2, satura di vapore acqueo durante la notte.
- Precedente infezione di cellule di cancro, oltre culture notte del tk RNAi vettore contenente E. coli sono misurati in un fotometro per determinare il diametro esterno 600. Diluire la soluzione batterica fino a una densità ottica di 0,5 si raggiunge (600 OD = 0,5 è uguale a 1,6 x 10 8 cellule batteriche / ml).
- Sostituire la FCS-contenente terreno di coltura di cellule del carcinoma a cellule contro FCS-free medio 30 minuti precedenti batterica co-incubazione.
- Lavare due volte i batteri con 1 x PBS, e diluire nel siero senza Leibovitz L-15 di media.
- Aggiungi batteri diluito per le cellule tumorali al desiderato MOI (molteplicità di infezione = numero di cellule batteriche per cella cancro) e co-incubare i batteri e le cellule tumorali per 2 ore a 37 ° C.
- Dopo 2 ore di co-incubazione le cellule tumorali sono state lavate due volte con PBS 1x x e una volta con siero contenente Leibovitz L-15 di media integrato con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 mg / ml di amfotericina, 150 mcg / ml di gentamicina e 100 mg / ml kanamicina.
- Continuare a coltivare le cellule tumorali a 37 ° C, in atmosfera al 5% di CO 2, satura di vapore acqueo.
- Gli effetti del trattamento batteriche possono essere visualizzati al microscopio a fluorescenza, misurata mediante quantitativa real-time PCR, RT a livello di mRNA, e attraverso l'analisi western blot a livello di proteine, e mostrato con test funzionali come l'analisi FACS, e saggi di proliferazione cellulare. (Se voluto, queste procedure possono essere descritte in dettaglio).
2) Rappresentante Risultati
Se il protocollo viene eseguita correttamente, i risultati dovrebbero essere paragonabili a quelli riportati di seguito.
Microscopia a fluorescenza
La figura 1 mostra una cellula umana carcinoma gastrico tre ore dopo il trattamento batterica (a) in confronto a una cella non trattata (b). Attorno al nucleo della cellula trattata, i batteri possono essere rilevati.
Figura 1: la microscopia a fluorescenza di cellule umane di carcinoma gastrico dopo trattamento batterica (1:500) e un trattato di cellule umane di carcinoma gastrico, come controllo, DAPI-colorazione, DAPI filtro passa-banda (Λem = 640 nm), obiettivo 40x.
Quantitativa real-time RT PCR
Nella figura 2 un regolamento giù di MDR1 mRNA di circa il 70% (fascio nero) possono essere osservati dopo trattamento con i batteri terapeutico. Cellule parentali servire come controllo positivo a causa della mancanza di MDR1 sovraespressione. La linea cellulare 257RDB P170 contenente un plasmide che esprime anti-MDR1 shRNAs s preso come confronto diretto della tecnologia transkingdom RNAi ad altri RNAi tacere strategie. La linea di cellule non trattate resistenti EPG85-257RDB sovraespressione MDR1, la linea stessa cella trattati con batteri privi del shRNA esprimere plasmide, e questa linea di cellule trattate con i batteri terapeutico porta un plasmide che esprime anti-MRP2 shRNAs sono stati presi come controlli positivi.
Figura 2: quantitativa real-time PCR, RT espressione di mRNA MDR1 dopo il trattamento terapeutico con E. coli ceq221 esprimere anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). La normalizzazione è stata effettuata utilizzando il dell'aldolasi gene housekeeping. Il rapporto MDR1/aldolase di cellule non trattate della linea cellulare EPG85-257RDB sono stati fissati al 100%. P-valori sono stati calcolati utilizzando dello studente t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Western Blot analisi
La figura 3 mostra che il MDR1 giù regolamento ha avuto luogo a livello della proteina batterica dopo il trattamento. Essa mostra la mancanza MDR1 espressione del sensibile linea cellulare di droga dei genitori (EPG85-257P), l'espressione di MDR1 non trattata linea cellulare resistente ai farmaci (EPG85-257RDB) e la MDR1 espressione del campione trattato. Un regolamento chiaro giù di MDR1 delle cellule trattate batteri possono essere osservati. 
Figura 3: analisi di Western Blot MDR1 livelli di espressione dei non trattati farmaco-sensibile EPG85-257P, la non trattati farmaco-resistente EPG-257RDB, e di EPG85-257RDB dopo la co-incubazione con E.. coli ceq221 + P43 MDR1. Ab primario C219 1:100 e anti-actina 1:5 000, secondaria Ab anti-topo 1:10 000.
Test di citotossicità
Analisi funzionale come il test di citotossicità in figura 4 sono anche indicatori per il funzionamento della RNAi transkingdom. La linea cellulare dei genitori e la linea cellulare contenente un anit-MDR1 shRNA esprimere plasmide non mostrano alcuna resistenza alla daunorubicina. La linea cellulare resistente EPG85-257RDB e due ulteriori controlli non mostrano variazioni significative nella resistenza rispetto al campione trattato con anti-batteri MDR1 shRNA esprimere in cui la resistenza alla daunorubicina potrebbe essere invertita di circa il 90%.
Figura 4: test di citotossicità. Farmaco-specifici IC50-valori determinati da un test di citotossicità per la sopravvivenza delle cellule. P-valori sono stati calcolati utilizzando dello studente t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Antracicline accumulo di test
Secondo la ridotta resistenza dei campioni batteri trattati (figura 4), l'accumulo delle antracicline anti-cellule MDR1 shRNA trattati è aumentato di circa il 90% come mostrato in figura 5. La linea cellulare dei genitori e la linea cellulare 257RDB P170 mostrano un forte accumulo di daunorubicina fino al 100%. La variante resistente mostra raramente accumulo. Cellule trattate con farmaci anti-batteri MDR1 shRNA esprimere mostrano un aumento anthracyline accumulo del 90%.
Figura 5: saggio di accumulazione antraciclina. Accumulo antracicline delle cellule di carcinoma 6 giorni dopo il trattamento batterica misurato mediante citometria di flusso. P-valori sono stati calcolati utilizzando dello studente t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
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Discussion
Il numero di cellule seminate per le infezioni e il MOI corrispondenti usati, dipendono criticamente sulle linee cellulari sotto osservazione e la loro velocità di crescita. Per trovare il numero di cellule ottimale per la semina, pre-esperimenti per determinare la velocità di crescita sono fortemente raccomandati. Oltre a questo, MOIS diverse dovrebbero essere testati a causa della limitata estendere a cui le cellule possono sopportare l'invasione batterica senza morire di stress. Il punto ottimale di tempo in cui la regolazione verso il basso del gene sotto osservazione può variare. Si consiglia di effettuare esperimenti per un certo periodo di tempo per trovare le condizioni ottimali.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto dalla concessione nr. 01GU0615 del "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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