Summary
Voor de ontwikkeling van RNA-interferentie (RNAi)-gebaseerde therapieën, was een nieuwe strategie ontwikkeld, transkingdom RNAi (tkRNAi). Deze technologie maakt gebruik van niet-pathogene bacteriën te produceren en therapeutische short hairpin RNA (shRNA) leveren in doelcellen. Hier werd tkRNAi met succes toegepast voor omkering van de klassieke ABCB1-gemedieerde multidrug resistance (MDR) van kankercellen.
Abstract
RNA-interferentie (RNAi) staat voor een hoog effectief mechanisme voor de specifieke remming van mRNA-expressie. Naast zijn potentieel als een krachtig laboratorium instrument, de RNAi pathway lijkt veelbelovend te zijn voor therapeutische gebruik. Voor de ontwikkeling van RNA-interferentie (RNAi)-gebaseerde therapieën, levering van de RNAi-bemiddelen agenten om target cellen is een van de belangrijkste obstakels. Een nieuwe strategie om deze horde te overwinnen is transkingdom RNAi (tk RNAi). Deze technologie maakt gebruik van niet-pathogene bacteriën, zoals Escherichia coli, te produceren en therapeutische short hairpin RNA (shRNA) leveren in doel-cellen om RNAi induceren. Een van de eerste generatie tk RNAi-vector bemiddelen, TRIP, bevat de bacteriofaag T7 promoter voor expressie regulatie van een therapeutisch shRNA van belang. Bovendien TRIP heeft de Inv locus van Yersinia pseudotuberculosis dat invasin codeert, die natuurlijk niet-invasieve bacteriën vergunningen in te voeren β1-integrine-positieve zoogdiercellen en het HlyA gen van Listeria monocytogenes, die produceert listeriolysin O. Dit enzym kan de therapeutische shRNA om te ontsnappen aan entry blaasjes in het cytoplasma van de doelcel. TRIP constructen worden geïntroduceerd in een bevoegde niet-pathogene Escherichia coli stam, die T7 RNA polymerase die noodzakelijk zijn voor de T7 promoter gedreven synthese van shRNAs codeert. Een goed gekarakteriseerd kanker-geassocieerde doelwitmolecule voor de verschillende strategieën RNAi is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Dit ABC-transporter werkt als een drug extrusie pomp en bemiddelt de "klassieke" ABCB1-gemedieerde multidrug resistance (MDR) fenotype van menselijke kankercellen die wordt gekenmerkt door een specifieke cross resistentiepatroon. Verschillende ABCB1 expressie MDR kankercellen werden behandeld met anti-ABCB1 shRNA expressievector met E. coli. Deze procedure resulteerde in de activering van de RNAi trajecten in de kankercellen en een aanzienlijke neerwaartse regulatie van de ABCB1 codering mRNA, alsmede de bijbehorende drug extrusie pomp. Bijgevolg werd accumulatie van het geneesmiddel versterkt in de ongerepte resistente kankercellen en de MDR-fenotype werd teruggedraaid. Door middel van dit model de gegevens te verstrekken van de proof-of-concept dat tk RNAi is geschikt voor de modulatie van kanker-geassocieerde factoren, zoals ABCB1, in menselijke kankercellen.
Protocol
1) Bacteriële Levering van shRNAs
- Alvorens te beginnen met de bacteriecultuur, moet men zich voor te bereiden LB-medium en LB-agar.
- Voor de LB-medium afwegen gistextract (0,5% w / v), Bacto trypton (1,0% w / v), en NaCl (0,6% w / v) en verdun deze componenten in aqua bidest. De bereide oplossingen moeten worden gesteriliseerd in een autoclaaf en zijn dan klaar voor gebruik.
- Voor de LB-agar platen Bacto agar (1,5% w / v) moet worden toegevoegd aan het LB-medium voorafgaand aan sterilisatie.
- Verwarm LB-agar in de magnetron totdat de LB-agar volledig is opgelost. Laat de oplossing afkoelen tot de fles kan gemakkelijk worden aangeraakt zonder je te branden. Voeg kanamycine (100 mg / ml) voor de selectie van positieve klonen in verdere stappen.
- Bereid LB-agar platen bij een laminaire stroming bank (steriele omstandigheden) door pipetteren 20 ml van de LB-agar-oplossing in 10-cm Petri-schalen. Laat de platen afkoelen totdat de vloeistof is geworden solide. De platen zijn nu klaar voor gebruik en kan worden opgeslagen bij 4 ° C.
- ShRNA-codering expressievectoren worden getransformeerd in competente E. coli ceq221 door de warmte shock via de CaCl 2 procedure.
- Plaat de getransformeerde bacteriën op LB-agar platen bevattende 100 ug / ml kanamycine, sluit het deksel, de borden met parafilm zegel en op zijn kop bij 37 ° C te kweken gedurende de nacht.
- Inoculeren bacteriële mini culturen met positieve klonen door het oppakken gegroeid kolonies met een tandenstoker. Breng de tandenstoker in 7,0 ml vers LB-medium dat 100 mg / ml kanamycine en telen bij 37 ° C 's nachts op een shaker op 200 rpm.
- Inoculeren 100 ml vers LB-medium dat 100 mg / ml kanamycine 1:100 met het 's nachts mini-cultuur in een 1 liter erlenmeyer en incubeer bij 37 ° C' s nachts op een shaker op 200 rpm.
- Zaad 25 x 10 4; menselijke maag-carcinoom cellen (EPG85-257RDB) per well in 6 (aantal geënte cellen hangt af van de snelheid van de celgroei van de volgens cellijn confluentie moet ~ 70-80% binnen 24 uur na het zaaien worden) - goed gerechten en deze bij 37 incubeer ° C, in een 5% CO 2, waterdamp verzadigde atmosfeer 's nachts.
- Voorafgaand aan kankercel infectie, 's nachts culturen van tk RNAi vector-bevattende E. coli worden gemeten in een fotometer aan de OD 600 te bepalen. Verdun de bacteriële oplossing tot een optische dichtheid van 0,5 is bereikt (OD 600 = 0,5 is gelijk aan 1,6 x 10 8 bacteriële cellen / ml).
- Vervang de FCS-bevattende celcultuurmedium van de carcinoom cellen tegen FCS-vrij medium 30 minuten voorafgaand aan bacteriële co-incubatie.
- Twee keer wassen bacteriën met 1 x PBS, en verdund in serum-vrij Leibovitz L-15 medium.
- Voeg verdund bacteriën om kankercellen op de gewenste MOI (multipliciteit van infectie = aantal bacteriële cellen per kankercel) en co-incubeer bacteriën en kankercellen gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Na 2 uur co-incubatie kankercellen werden tweemaal gewassen met 1x x PBS en een keer met serum-bevattende Leibovitz L-15-medium aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2,5 ug / ml amfotericine, 150 ug / ml gentamicine, en 100 ug / ml kanamycine.
- Blijven cultiveren van de kankercellen bij 37 ° C, in een 5% CO 2, waterdamp verzadigde atmosfeer.
- De effecten van de bacteriële behandeling kan gevisualiseerd worden door fluorescentie microscopie, gemeten door kwantitatieve real-time RT PCR op mRNA niveau en door de western blot analyse op eiwitniveau, en weergegeven met functionele testen zoals FACS-analyse, en celproliferatie assays. (Indien gewenst, deze procedures kunnen worden beschreven in detail).
2) representatieve resultaten
Als het protocol correct wordt uitgevoerd, moeten de resultaten vergelijkbaar zijn met de hieronder weergegeven.
Fluorescentie microscopie
Figuur 1 toont een menselijke maag-carcinoom cellen drie uur na bacteriële behandeling (a) in vergelijking met een onbehandelde cel (b). Rond de kern van de behandelde cel, kunnen bacteriën worden gedetecteerd.
Figuur 1: fluorescentie microscopie Human maagcarcinoom cel na bacteriële behandeling (1:500) en een onbehandelde menselijke maag-carcinoom cellen als controle, DAPI-kleuring, DAPI banddoorlaatfilter (Λem = 640 nm), 40x objectief.
Kwantitatieve real-time RT PCR
In figuur 2 kan een neerwaartse regulatie van MDR1 mRNA van ongeveer 70% (zwarte balk) te zien na behandeling met de therapeutische bacteriën. Ouderlijke cellen fungeren als een positieve controle te wijten aan het gebrek aan MDR1 overexpressie. De cellijn 257RDB P170 met een plasmide dat anti-MDR1 shRNAs s genomen als directe vergelijking van de transkingdom RNAi-technologie naar andere RNAi zwijgen strategieën. De onbehandelde resistente cellijn EPG85-257RDB overexpressie MDR1, dezelfde cellijn die behandeld worden met bacteriën die niet over de shRNA uiten plasmide, en deze cellijn die behandeld worden met therapeutische bacteriën die een plasmide dat anti-MRP2 shRNAs werden als positieve controle.
Figuur 2: Kwantitatieve real-time RT PCR MDR1-mRNA-expressie na de behandeling met therapeutische E. coli ceq221 uiten van anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). Normalisering werd uitgevoerd met behulp van het huishouden gen aldolase. De MDR1/aldolase verhouding van onbehandelde cellen van de cellijn EPG85-257RDB werden 100%. P-waarden werden berekend met behulp van de student t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Western blot analyse
Figuur 3 laat zien dat de MDR1 downregulatie ook plaats vond op eiwit niveau na bacteriële behandeling. Het toont het ontbreken MDR1 uitdrukking van het geneesmiddel gevoelige ouderlijke cellijn (EPG85-257P), het MDR1 uitdrukking van de onbehandelde resistente cellijn (EPG85-257RDB) en de MDR1 uitdrukking van het behandelde monster. Een duidelijke neerwaartse regulatie van MDR1 van het bacterieel behandelde cellen kunnen worden waargenomen. 
Figuur 3: Western blot analyse MDR1 expressie niveaus van de onbehandelde drug-gevoelige EPG85-257P, de onbehandelde resistente EPG-257RDB, en van EPG85-257RDB na co-incubatie met E.. coli ceq221 + P43 MDR1. Primaire Ab C219 1:100, en anti-actine 01:05 000, secundaire Ab anti-muis 1:10 000.
Cytotoxiciteitstest
Functionele analyse, zoals de cytotoxiciteit assay weergegeven in figuur 4 zijn ook indicatoren voor het functioneren van de transkingdom RNAi. De ouderlijke cellijn en de cellijn met een anit-MDR1 shRNA uiten plasmide vertonen geen weerstand tegen daunorubicine. De resistente cellijn EPG85-257RDB en twee verdere controles tonen geen significante veranderingen in de weerstand in vergelijking met het monster behandeld met anti-MDR1 shRNA uitdrukken bacteriën waar de weerstand tegen daunorubicine kan worden omgekeerd met ongeveer 90%.
Figuur 4: cytotoxiciteit assay. Drug-specifieke IC50-waarden bepaald door een cytotoxiciteit assay voor de overleving van de cel. P-waarden werden berekend met behulp van de student t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Anthracycline accumulatie assay
Volgens de verminderde weerstand van bacterieel behandelde monsters (figuur 4), is de anthracycline accumulatie van de anti-MDR1 shRNA behandelde cellen verhoogd met ongeveer 90% zoals aangegeven in figuur 5. De ouderlijke cellijn en de cellijn 257RDB P170 een sterke daunorubicine accumulatie tot 100%. De resistente variant toont zelden accumulatie. Cellen behandeld met anti-MDR1 shRNA uitdrukken bacteriën vertonen een opeenstapeling anthracyline stijging van 90%.
Figuur 5: antracyclinen accumulatie test. Antracycline accumulatie van carcinoomcellen 6 dagen na bacteriële behandeling gemeten door middel van flowcytometrie. P-waarden werden berekend met behulp van de student t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het aantal cellen gezaaid voor infectie en de bijbehorende MOI gebruikte mate afhangen van de cellijnen onder observatie en hun snelheid van de groei. Om te weten een optimale cel nummers voor het zaaien, zijn pre-experimenten om de snelheid van de groei te bepalen sterk aanbevolen. Daarnaast moeten verschillende MOIS worden getest vanwege de beperkte mate waarin de cellen kan de bacteriële invasie staan zonder te sterven van de stress. De optimale tijdstip waar de down regulatie van het gen onder observatie kan variëren. Het wordt aanbevolen om experimenten uit te voeren over een bepaalde periode de tijd om de optimale condities te vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werk werd ondersteund door subsidie niet. 01GU0615 van het "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
