Summary
Für die Entwicklung der RNA-Interferenz (RNAi)-basierte Therapien, wurde eine neue Strategie entwickelt, transkingdom RNAi (tkRNAi). Diese Technologie nutzt nicht-pathogenen Bakterien zu produzieren und zu liefern therapeutische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) in Zielzellen. Hier wurde tkRNAi erfolgreich Umkehrung der klassischen ABCB1-vermittelte Multidrug-Resistenz (MDR) von Krebszellen eingesetzt.
Abstract
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein hoch wirksamer Mechanismus für die spezifische Hemmung der mRNA-Expression. Neben ihr Potenzial als ein leistungsfähiges Labor-Tool, erscheint der RNAi für therapeutische Nutzung vielversprechend. Für die Entwicklung der RNA-Interferenz (RNAi)-basierte Therapien, die Lieferung von RNAi-vermittelnde Agenten an Zielzellen ist eine der größten Hindernisse. Eine neuartige Strategie, diese Hürde zu überwinden, ist transkingdom RNAi (tk RNAi). Diese Technologie nutzt nicht-pathogene Bakterien, z. B. Escherichia coli, zu produzieren und zu liefern therapeutische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) in Zielzellen zu RNAi zu induzieren. Eine der ersten Generation tk RNAi-vermittelnde Vektor, TRIP, enthält die Bakteriophagen T7 Promotor für die Expression Regulation eines therapeutischen shRNA von Interesse. Darüber hinaus hat die TRIP Inv locus von Yersinia pseudotuberculosis, dass Invasin kodiert, die natürliche invasive Bakterien erlaubt, β1-Integrin-positiven Säugetierzellen und die HlyA Gen aus Listeria monocytogenes, die Listeriolysin O. Dieses Enzym produziert eingeben kann die therapeutische shRNA zu entkommen Eintrag Vesikel im Zytoplasma der Zielzelle. TRIP-Konstrukte sind zu einem kompetenten nicht-pathogene Escherichia coli-Stamm, der T7-RNA-Polymerase, die für die T7-Promotor-gesteuerte Synthese von shRNAs kodiert eingeführt. Ein gut charakterisierter Krebs-assoziierte Zielmolekül für unterschiedliche RNAi-Strategien ist ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Das ABC-Transporter fungiert als eine Droge Extrusionspumpe und vermittelt die "klassische" ABCB1-vermittelte Multidrug-Resistenz (MDR) Phänotyp von menschlichen Krebszellen, die durch eine spezifische Kreuzresistenz Muster geprägt ist. Verschiedene ABCB1-exprimierende MDR Krebszellen wurden mit anti-ABCB1 shRNA Expressionsvektor trägt E. behandelt coli. Dieses Verfahren führte zu einer Aktivierung der RNAi Wege innerhalb der Krebszellen und eine beträchtliche Down-Regulation der ABCB1 codierenden mRNA sowie den entsprechenden Medikamenten Extrusionspumpe. Dementsprechend wurde Kumulation in der unberührten resistente Krebszellen verbessert und die MDR Phänotyp wurde rückgängig gemacht. Durch dieses Modell die Daten liefern die Proof-of-concept, dass tk RNAi geeignet für die Modulation von Krebs-assoziierte Faktoren, z. B. ABCB1, in menschlichen Krebszellen ist.
Protocol
1) Bakterielle Lieferung von shRNAs
- Bevor Sie mit der Bakterienkultur, muss man LB-Medium und LB-Agar vorzubereiten.
- Für die LB-Medium abwiegen Hefeextrakt (0,5% w / v), Bacto Trypton (1,0% w / v) und NaCl (0,6% w / v) gelöst und diese Komponenten in aqua bidest. Die vorbereiteten Lösungen müssen in einem Autoklaven sterilisiert werden und sind dann einsatzbereit.
- Für LB-Agarplatten Bacto-Agar (1,5% w / v) muss an die LB-Medium früheren zur Sterilisation hinzugefügt werden.
- Aufheizen LB-Agar in der Mikrowelle bis zur LB-Agar vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Lösung abkühlen, bis die Flasche leicht und ohne sich zu verbrennen berührt werden. Add Kanamycin (100 mg / ml) für die Auswahl der positiven Klone in weiteren Schritten.
- Bereiten LB-Agar-Platten bei einer laminaren Strömung Bank (sterile Bedingungen) durch Pipettieren 20 ml des LB-Agar-Lösung in 10-cm Petrischalen. Lassen Sie die Platten abkühlen, bis die Flüssigkeit fest geworden ist. Die Platten sind jetzt einsatzbereit und kann bei 4 ° C gelagert werden.
- ShRNA-kodierende Expressionsvektoren sind in kompetente E. verwandelt coli ceq221 durch Hitzeschock mit der CaCl 2-Verfahren.
- Platte der transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten mit 100 pg / ml Kanamycin, den Deckel schließen, verschließen Sie die Platten mit Parafilm und pflegen den Kopf bei 37 ° C über Nacht.
- Impfen bakterielle mini Kulturen mit positiven Klone durch Abnehmen gewachsenen Kolonien mit einem Zahnstocher. Übertragen Sie die Zähne in 7,0 ml frisches LB-Medium mit 100 mg / ml Kanamycin und pflegen bei 37 ° C über Nacht auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute zu pflücken.
- Inoculate 100 ml frischem LB-Medium mit 100 mg / ml Kanamycin 1:100 mit dem über Nacht Mini-Kultur in einem 1 l-Erlenmeyerkolben, und bei 37 ° C über Nacht auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute.
- Seed 25 x 10 4; menschlichen Magen-Karzinom-Zellen (EPG85-257RDB) pro Well in 6 (Anzahl der ausgesäten Zellen hängt von der Geschwindigkeit des Zellwachstums der nach Zelllinie Konfluenz sollten ~ 70-80% 24 Stunden nach der Aussaat werden) - auch Speisen und inkubieren diese bei 37 ° C, in einem 5% CO 2, Wasserdampf gesättigten Atmosphäre über Nacht.
- Zurück zur Krebszelle Infektion über Nacht Kulturen tk RNAi-Vektor-haltigen E. coli sind in einem Photometer die OD 600 zu bestimmen. Verdünnen Sie die bakterielle Lösung bis eine optische Dichte von 0,5 erreicht ist (OD 600 = 0,5 gleich 1,6 x 10 8 Bakterienzellen / ml).
- Ersetzen Sie die FCS-haltigen Zellkulturmedium der Karzinom-Zellen gegen FCS-freiem Medium 30 min früheren bakterielle Co-Inkubation.
- Wash Bakterien zweimal mit 1 x PBS, und verdünnen in serum-freien Leibovitz L-15-Medium.
- Add verdünnt Bakterien, Krebszellen in der gewünschten MOI (Multiplizität der Infektion = Anzahl der Bakterienzellen pro Krebszelle) und Co-Inkubation von Bakterien und Krebszellen für 2 Stunden bei 37 ° C.
- Nach 2 Stunden Co-Inkubation Krebszellen wurden zweimal mit 1x x PBS gewaschen und einmal mit serumhaltigem Leibovitz L-15-Medium mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2,5 pg / ml Amphotericin, 150 ug / ergänzt ml Gentamicin und 100 ug / ml Kanamycin.
- Weiter pflegen die Krebszellen bei 37 ° C in einer 5% CO 2, Wasserdampf gesättigten Atmosphäre.
- Die Auswirkungen der bakteriellen Behandlung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, durch quantitative real-time RT-PCR auf mRNA-Ebene gemessen und mittels Western-Blot-Analyse auf Protein-Ebene sichtbar gemacht und gezeigt, mit funktionellen Assays wie FACS-Analyse und Zellproliferationsassays. (Falls gewünscht, können diese Verfahren im Detail beschrieben werden).
2) repräsentative Ergebnisse
Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollten die Ergebnisse vergleichbar sein, die nachfolgend dargestellt ist.
Fluoreszenzmikroskopie
Abbildung 1 zeigt einen menschlichen Magenkarzinom Zelle drei Stunden nach der bakteriellen Behandlung (a) im Vergleich zu einer unbehandelten Zellen (b). Rund um den Kern der behandelten Zelle, können Bakterien nachgewiesen werden.
Abbildung 1: Fluoreszenz-Mikroskopie menschlichen Magenkarzinom Zelle nach der bakteriellen Behandlung (1:500) und einer unbehandelten menschlichen Magenkarzinom Zelle als Steuer-, DAPI-Färbung, DAPI Bandpassfilter (Λem = 640 nm), 40x.
Quantitative real-time RT-PCR
In Abbildung 2 kann eine Down-Regulation der MDR1 mRNA von ca. 70% (schwarzer Balken) nach der Behandlung mit dem therapeutischen Bakterien gesehen werden. Parental-Zellen dienen als positive Kontrolle durch das Fehlen von MDR1-Überexpression. Die Zelllinie 257RDB P170 mit einem Plasmid, das anti-MDR1 shRNAs s als direkter Vergleich der transkingdom RNAi-Technologie mit anderen R genommenNAi silencing Strategien. Die unbehandelten resistent Zelllinie EPG85-257RDB überexprimierenden MDR1, die gleiche Zelllinie mit Bakterien ohne die shRNA exprimierenden Plasmid behandelt, und diese Zelllinie behandelt mit therapeutischen Bakterien, die ein Plasmid Ausdruck anti-MRP2 shRNAs wurden als positive Kontrollen.
Abbildung 2: Quantitative real-time RT-PCR MDR1 mRNA-Expression nach Behandlung mit therapeutischen E. coli ceq221 Ausdruck anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). Die Normalisierung erfolgte mit dem Housekeeping-Gen Aldolase. Die MDR1/aldolase Verhältnis von unbehandelten Zellen der Zelllinie EPG85-257RDB wurden 100% gesetzt. P-Werte wurden mit dem Student-t-Test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Western-Blot-Analyse
Abbildung 3 zeigt, dass die MDR1 Downregulation erfolgte auch auf Protein-Ebene nach der bakteriellen Behandlung. Es zeigt die fehlende MDR1 Expression des Medikaments sensible Eltern Zelllinie (EPG85-257P), die MDR1 Expression der unbehandelten resistente Zelllinie (EPG85-257RDB) und der MDR1 Expression der behandelten Probe. Eine klare Down-Regulation der MDR1 der bakteriell behandelten Zellen beobachtet werden kann. 
Abbildung 3: Western-Blot-Analyse MDR1 Expression der unbehandelten Droge-sensitive EPG85-257P, das unbehandelte resistenten EPG-257RDB und der EPG85-257RDB nach Ko-Inkubation mit E.. coli ceq221 + p43 MDR1. Primäre Ab C219 1:100 und anti-Aktin 1:5 000, sekundäre Ab-Anti-Maus 1:10 000.
Zytotoxizitätsassay
Funktionelle Analyse wie die Zytotoxizitätsassay in Abbildung 4 dargestellt sind auch Indikatoren für das Funktionieren des transkingdom RNAi. Die elterliche Zelllinie und der Zell-Linie, die eine anit-MDR1 shRNA exprimierenden Plasmid zeigen keine Resistenz gegenüber Daunorubicin. Die resistenten Zelllinie EPG85-257RDB und zwei weitere Kontrollen keine signifikanten Änderungen des Widerstandes im Vergleich zu der Probe mit anti-MDR1 shRNA exprimierenden Bakterien, wo der Widerstand gegen Daunorubicin um ca. 90% rückgängig gemacht werden könnte behandelt.
Abbildung 4: Zytotoxizitätsassay. Drug-spezifische IC50-Werte von einem Zytotoxizitätstest für das Überleben der Zelle bestimmt. P-Werte wurden mit dem Student-t-Test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Anthrazyklin Anhäufung Test
Nach Angaben der Abwehrschwäche von bakteriell behandelten Proben (Abbildung 4) wird die Anthrazyklin Ansammlung von anti-MDR1 shRNA behandelten Zellen um etwa 90% erhöht, wie in Abbildung 5 dargestellt. Die elterliche Zelllinie und die Zelllinie 257RDB P170 zeigen eine starke Daunorubicin Anhäufung von bis zu 100%. Die resistenten Variante zeigt nur selten eine Akkumulation. Zellen mit anti-MDR1 shRNA exprimierenden Bakterien behandelt zeigen eine Anthracyclin Anhäufung Steigerung von 90%.
Abbildung 5: Anthrazyklin Anhäufung Assay. Anthrazyklin Ansammlung von Karzinomzellen 6 Tage nach der bakteriellen Behandlung mittels Durchflusszytometrie gemessen. P-Werte wurden mit dem Student-t-Test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
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Discussion
Die Zellzahl für eine Infektion ausgesät und die entsprechenden MOI verwendet, sich kritisch mit den Zelllinien unter Beobachtung und deren Geschwindigkeit des Wachstums ab. Um eine optimale Zellzahl für die Aussaat sind pre-Experimente, um die Geschwindigkeit des Wachstums bestimmen dringend empfohlen. Daneben sollten verschiedene MOIs aufgrund der begrenzten getestet werden zu verlängern, um die Zellen können die bakterielle Invasion, ohne zu sterben von Stress stehen. Der optimale Zeitpunkt, wo die Down-Regulation des Gens unter Beobachtung kann variieren. Es wird empfohlen, Versuche über einen gewissen Zeitraum, um die optimalen Bedingungen zu finden durchzuführen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Arbeit wurde durch Grant nicht unterstützt. 01GU0615 des "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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