Summary
Pour le développement de l'interférence ARN (ARNi) thérapies basées sur une nouvelle stratégie a été développée, transkingdom ARNi (tkRNAi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles. Ici, tkRNAi a été appliquée avec succès pour le renversement de la multirésistance classique ABCB1 médiation (MDR) des cellules cancéreuses.
Abstract
L'interférence ARN (ARNi) représente un mécanisme de haute efficace pour l'inhibition spécifique de l'expression de l'ARNm. Outre son potentiel comme outil de laboratoire puissant, la voie de l'ARNi semble être prometteuse pour l'utilisation thérapeutique. Pour le développement de l'interférence ARN (ARNi) basé sur les thérapies, la livraison de l'ARNi médiation des agents à des cellules cibles est l'un des obstacles majeurs. Une nouvelle stratégie pour surmonter cet obstacle est transkingdom ARNi (tk ARNi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes, par exemple, Escherichia coli, pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles pour induire l'ARNi. Une première génération tk ARNi médiation vecteur, TRIP, contient le promoteur du bactériophage T7 pour régulation de l'expression d'un shRNA thérapeutiques d'intérêt. Par ailleurs, TRIP a le locus Inv partir de Yersinia pseudotuberculosis qui encode invasine, qui permet naturelle des bactéries non invasives d'entrer β1-intégrine-positif cellules de mammifères et le gène HlyA partir de la bactérie Listeria monocytogenes, qui produit listériolysine O. Cet enzyme permet le shRNA thérapeutiques pour échapper à d'entrée des vésicules dans le cytoplasme de la cellule cible. Construit TRIP sont introduits dans une compétents souche non pathogène Escherichia coli, qui code T7 RNA polymérase nécessaire à l'promoteur T7 axée synthèse de shRNA. Une molécule cible bien caractérisé associée au cancer pour les stratégies de RNAi différents ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Ce ABC-transporteur agit comme une pompe d'extrusion de drogue et médiatise la "classique" multirésistance ABCB1 médiation (MDR) phénotype des cellules cancéreuses humaines qui se caractérise par un profil de résistance croisée spécifique. ABCB1 exprimant différentes cellules cancéreuses ont été MDR traités par anti-ABCB1 shRNA vecteur d'expression portant E. coli. Cette procédure a abouti à l'activation des voies de l'ARNi dans les cellules cancéreuses et une réglementation considérable bas de l'ARNm de ABCB1 encodage ainsi que la pompe d'extrusion médicament correspondant. En conséquence, l'accumulation du médicament a été renforcée dans les cellules du cancer primitif résistantes aux médicaments et le phénotype MDR a été inversé. Au moyen de ce modèle les données fournissent la preuve de concept que les savoirs traditionnels ARNi est adapté à la modulation de cancer associés à des facteurs, par exemple ABCB1 dans des cellules cancéreuses humaines.
Protocol
1) Livraison bactérienne des shRNA
- Avant de commencer avec la culture bactérienne, il faut se préparer milieu LB et LB-agar.
- Pour le milieu LB peser extrait de levure (0,5% p / v), Bacto tryptone (1,0% p / v), et du NaCl (0,6% p / v) et diluer ces composants dans de l'eau bidest. Les solutions préparées doivent être stérilisés dans un autoclave et sont alors prêtes à utiliser.
- Pour LB-agar gélose Bacto (1,5% p / v) doit être ajoutée à la précédente milieu LB à la stérilisation.
- Chauffer LB-agar dans le micro-ondes jusqu'à ce que le LB-agar soit complètement dissoute. Laisser la solution refroidir jusqu'à ce que la bouteille peut être touché facilement sans se brûler. Ajouter à la kanamycine (100 mg / ml) pour la sélection de clones positifs dans d'autres mesures.
- Préparer LB-agar sur un banc à flux laminaire (conditions stériles) par pipetage 20 ml de la solution de LB-agar en 10 cm de Petri-plats. Laissez les plaques refroidir jusqu'à ce le liquide est devenu solide. Les plaques sont maintenant prêts à utiliser et peut être conservé à 4 ° C.
- Des vecteurs d'expression ShRNA-encodage sont transformées en compétents E. coli ceq221 par choc thermique utilisant la procédure de CaCl 2.
- Plaque les bactéries transformées sur LB-agar contenant 100 ug / ml de kanamycine, fermez le couvercle, sceller les plaques avec du parafilm et cultiver l'envers à 37 ° C pendant la nuit.
- Inoculer les cultures bactériennes mini clones positifs en choisissant colonies cultivées avec un cure-dent. Transférer le cure-dent dans 7,0 ml de milieu LB frais contenant 100 mg / ml de kanamycine et de cultiver à 37 ° C pendant la nuit sur un agitateur à 200 tpm.
- Inoculer 100 ml de milieu LB frais contenant 100 mg / ml de kanamycine 1:100 avec la culture nuit sur un mini dans un flacon de 1 litre Erlenmeyer, et incuber à 37 ° C pendant la nuit sur un agitateur à 200 tpm.
- Graine de 25 x 10 4 (nombre de cellules ensemencées dépend de la vitesse de croissance des cellules de la lignée cellulaire selon; confluence devrait être ~ 70-80% 24 heures après l'ensemencement) des cellules de carcinome gastrique (EPG85-257RDB) par puits dans 6 - plats puits et incuber ces à 37 ° C, dans une atmosphère de 5% de CO 2, vapeur d'eau saturée pendant la nuit.
- Précédente à l'infection des cellules cancéreuses, sur les cultures nuit du tk ARNi contenant le vecteur E. coli sont mesurés dans un photomètre pour déterminer la DO 600. Diluer la solution bactérienne jusqu'à une densité optique de 0,5 est atteint (DO600 = 0,5 équivaut à 1,6 x 10 8 cellules bactériennes / ml).
- Remplacez le support SVF contenant des cellules de culture des cellules carcinomes contre la FCS milieu sans précédent pour 30 min bactérienne co-incubation.
- Laver deux fois avec des bactéries 1 x PBS, et diluer dans le sérum sans Leibovitz milieu L-15.
- Ajouter des bactéries aux cellules cancéreuses diluée au désirée MOI (multiplicité d'infection = nombre de cellules bactériennes par des cellules cancéreuses) et co-incubation des bactéries et des cellules cancéreuses pendant 2 heures à 37 ° C.
- Après 2 heures de cellules de cancer co-incubation ont été lavés deux fois avec du PBS 1x x et une fois avec du sérum contenant Leibovitz L-15 milieu supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine, 150 ug / ml de gentamicine, et 100 pg / ml de kanamycine.
- Continuer à cultiver les cellules cancéreuses à 37 ° C, dans une atmosphère de 5% de CO 2, la vapeur d'eau saturée.
- Les effets du traitement bactérienne peut être visualisé par microscopie à fluorescence, mesurée par PCR quantitative en temps réel sur le niveau d'ARNm RT, et par analyse western blot sur le niveau de protéines, et indiqué avec des dosages fonctionnels tels que l'analyse FACS, et les tests de prolifération cellulaire. (Si voulu, ces procédures peuvent être décrites en détail).
Résultats Représentant 2)
Si le protocole est réalisé correctement, les résultats devraient être comparables à celles indiquées ci-dessous.
La microscopie à fluorescence
La figure 1 montre un carcinome gastrique humaine trois heures après le traitement bactérienne (a) en comparaison à une cellule non traitée (b). Autour du noyau de la cellule traitée, les bactéries peuvent être détectées.
Figure 1: Fluorescent microscope de cellules humaines carcinome gastrique après traitement bactérien (1:500) et d'une cellule humaine non traitée carcinome gastrique comme témoin, DAPI-coloration, passe-bande DAPI filtre (Λem = 640 nm), objectif 40x.
Quantitative en temps réel RT-PCR
Dans la figure 2 une régulation négative de l'ARNm du gène MDR1 d'environ 70% (faisceau noir) peuvent être observés après traitement avec la bactérie thérapeutiques. Cellules parentales servir de contrôle positif en raison de l'absence d'une surexpression du gène MDR1. La lignée cellulaire 257RDB p170 contenant un plasmide exprimant anti-MDR1 shRNA s pris comme comparaison directe de la technologie ARNi pour transkingdom R d'autresNAi taire stratégies. La lignée cellulaire résistante traitée EPG85-257RDB surexprimant MDR1, la même lignée cellulaire traités avec des bactéries qui n'ont pas les shRNA plasmide exprimant, et cette lignée de cellules traitées avec des bactéries thérapeutiques portant un plasmide exprimant anti-MRP2 shRNA ont été pris comme contrôles positifs.
Figure 2: quantitative en temps réel RT-PCR l'expression des ARNm du gène MDR1 après le traitement avec des produits thérapeutiques E. coli exprimant ceq221 anti-MDR1 shRNA (MOI 1: 500). Normalisation a été réalisée en utilisant l'aldolase gène de ménage. Le ratio MDR1/aldolase des cellules non traitées de la lignée cellulaire EPG85-257RDB ont été de 100%. P-valeurs ont été calculées à l'aide de l'étudiant t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Western blot
La figure 3 montre que le MDR1 la régulation négative a également eu lieu sur le niveau de protéine bactérienne après le traitement. Elle montre le manque d'expression du gène MDR1 de la drogue lignée cellulaire parentale sensibles (EPG85-257P), l'expression du gène MDR1 de la lignée cellulaire de drogue traitées résistant (EPG85-257RDB) et l'expression du gène MDR1 de l'échantillon traité. Une réglementation claire en bas de MDR1 des cellules des bactéries traitées peuvent être observés. 
Figure 3: Analyse par Western blot MDR1 niveaux d'expression des traités sensible aux médicaments EPG85-257P, la non traité résistant aux médicaments EPG-257RDB et des EPG85-257RDB après co-incubation avec E.. coli ceq221 + p43 MDR1. Ab primaire C219 1:100, et anti-actine 1:5 000, secondaire Ab anti-souris 1:10 000.
Test de cytotoxicité
L'analyse fonctionnelle comme le test de cytotoxicité montre la figure 4 sont également des indicateurs pour le fonctionnement de l'ARNi transkingdom. La lignée cellulaire parentale et la lignée cellulaire contenant un shRNA anit-MDR1 plasmide exprimant ne montrent aucune résistance à la daunorubicine. La lignée cellulaire résistante EPG85-257RDB et deux contrôles supplémentaires ne montrent pas des changements importants dans la résistance en comparaison de l'échantillon traité avec des bactéries shRNA anti-MDR1 exprimer où la résistance à la daunorubicine pu être renversé par environ 90%.
Figure 4: test de cytotoxicité. Médicaments spécifiques IC50-valeurs déterminées par un essai de cytotoxicité à la survie cellulaire. P-valeurs ont été calculées à l'aide de l'étudiant t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Dosage de l'accumulation d'anthracyclines
Selon la résistance des bactéries abaissé d'échantillons traités (figure 4), l'accumulation de cellules anthracycline shRNA anti-MDR1 traitée est augmenté d'environ 90% comme indiqué dans la figure 5. La lignée cellulaire parentale et la lignée cellulaire 257RDB p170 montrent une forte accumulation daunorubicine jusqu'à 100%. La variante résistante montre rarement toute accumulation. Les cellules traitées avec des bactéries shRNA anti-MDR1 exprimer montrent une augmentation de l'accumulation anthracycline de 90%.
Figure 5: dosage de l'accumulation des anthracyclines. L'accumulation des anthracyclines de cellules de carcinome 6 jours après le traitement bactérienne mesurée par cytométrie en flux. P-valeurs ont été calculées à l'aide de l'étudiant t-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
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Discussion
Le nombre de cellules ensemencées pour l'infection et la MOI correspondants utilisés, dépendent essentiellement sur les lignées cellulaires sous observation et leur vitesse de croissance. Pour trouver le nombre de cellules optimales pour le semis, pré-expériences pour déterminer la vitesse de croissance sont fortement recommandées. Outre cela, IAM de différents doivent être testés en raison de la limite d'étendre à laquelle les cellules peuvent se l'invasion bactérienne sans mourir de stress. Le point optimale du temps où la régulation à la baisse du gène de la sous observation peut varier. Il est recommandé d'effectuer des expériences sur une certaine période de temps pour trouver les conditions optimales.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les travaux ont été soutenus par des subventions non. 01GU0615 du «Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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