Summary
RNA enterferans (RNAi) tabanlı tedaviler geliştirilmesi için, yeni bir strateji, transkingdom RNAi (tkRNAi) geliştirildi. Bu teknoloji üretmek ve hedef hücrelerine terapötik kısa saç tokası RNA (shRNA) teslim etmek için non-patojenik bakterilerin kullanır. Burada, tkRNAi klasik kanser hücrelerinin ABCB1 aracılı çoklu ilaç direnci (MDR) iptali için başarıyla uygulanmıştır.
Abstract
RNA enterferans (RNAi) mRNA spesifik inhibisyonu için yüksek etkili bir mekanizma temsil eder. Yanı sıra, güçlü bir laboratuar aracı olarak potansiyel RNAi yolu terapötik kullanımı için umut verici görünüyor. RNAi RNA girişim (RNAi) tabanlı tedaviler, teslim geliştirilmesi için aracılık hedef hücreleri ajanların en büyük engellerden biridir. Bu engeli aşmak için yeni bir strateji transkingdom RNAi (Tk RNAi). Bu teknoloji üretmek ve tedavi kısa saç tokası RNA (shRNA) teslim RNAi neden hedef hücrelerine, patojen olmayan bakteriler, örneğin Escherichia coli kullanır. İlk nesil tk RNAi-aracılık vektörü, TURU, terapötik bir ilgi shRNA ifade düzenlenmesi için bakteriyofaj T7 organizatörü içerir. Ayrıca, TRIP doğal noninvaziv bakteri β1-integrin pozitif memeli listeriolysin O. Bu enzim üreten hücreleri ve Listeria monocytogenes HlyA gen, girmek için izin verir invasin kodlar Yersinia pseudotuberculosis Yat odağı, tedavi shRNA kaçmak sağlar giriş, hedef hücre sitoplazma içinde vezikül. TRIP yapıları shRNAs, T7 organizatörü odaklı sentezi için gerekli olan T7 RNA polimeraz kodlar yetkili bir patojen olmayan Escherichia coli suşu, içine tanıtıldı . Farklı RNAi stratejileri için iyi karakterize bir kanser ilişkili hedef molekülü ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Bu bir ilaç ekstrüzyon pompa ve aracılık "klasik" ABCB1-aracılı çoklu ilaç direnci (MDR) belirli bir çapraz direnç paterni ile karakterize olan insan kanser hücrelerinin fenotipi olarak ABC taşıyıcı davranır. Farklı ABCB1 ifade MDR kanser hücrelerinin anti-ABCB1 shRNA ifade vektör taşıyan E. ile tedavi edildi coli. Bu prosedür içinde RNAi yollarının kanser hücrelerinin aktivasyonu ve ABCB1 kodlama mRNA önemli bir down-regülasyonu yanı sıra ilgili ilaç ekstrüzyon pompa sonuçlandı. Buna göre, ilaç birikimi bozulmamış ilaca dirençli kanser hücrelerinin gelişmiş ve MDR fenotip tersine dönmüştür. Bu model sayesinde veri tk RNAi insan kanser hücreleri kanser ilişkili faktörler, örneğin ABCB1 modülasyonu için uygun olduğunu proof-of-concept sağlar.
Protocol
1) shRNAs Bakteriyel Teslimat
- Bakteri kültürü ile başlamadan önce, bir LB-orta ve LB-agar hazırlamak zorundadır.
- LB-orta maya özü (% 0.5 w / v), bacto Tripton (% 1.0 w / v) ve NaCl (% 0.6 w / v), tartmak ve aqua bidest bu bileşenleri sulandırmak için. Hazırlanan çözümler otoklavda sterilize olması ve sonra kullanıma hazır.
- LB-agar plaklarına için bacto agar (% 1.5 w / v) sterilizasyon önceki LB-orta eklenecek.
- LB-agar, mikrodalga, LB-agar tamamen eriyene kadar isitin. Şişe yandı almadan kolayca dokundu kadar çözüm soğumaya alalım. Daha ileri adımlar olumlu klonların seçimi için kanamisin (100 mg / ml) ekleyin.
- LB-agar plakları 10 cm Petri kaplarına 20 ml LB-agar çözüm pipetleme laminer akış tezgah (steril koşullar) hazırlayın. Plakalar, sıvı katı hale gelene kadar soğumaya alalım. Plakalar, artık kullanıma hazır ve 4 ° C'de saklanabilir.
- ShRNA-kodlaması ekspresyon vektörleri yetkili E. dönüştü. CaCl 2 yordamı kullanarak ısı şok coli ceq221.
- Plaka 100 mcg / ml kanamisin içeren LB-agar plaklarına dönüştürülmüş bakteri, kapağını kapatın parafilm ile plakaları ve baş aşağı 37 ° yetiştirmek ° C, gece boyunca.
- Diş çekme ile yetiştirilen koloniler seçerek olumlu klonları ile bakteriyel mini kültürleri inoküle edin. Diş, 100 mg / ml kanamisin ve ° C gece boyunca 200 rpm'de çalkalayıcı üzerinde 37 yetiştirmek içeren taze LB-orta 7,0 ml içine almak aktarın.
- İnokülasyon 100 ml taze LB-orta, 37 ° C gece boyunca 200 rpm'de çalkalamalı üzerinde gece 1 litre Erlenmeyer şişesinin içinde bir mini kültür ve inkübe ile 100 mg / ml kanamisin 1:100 içeren
- Tohum 25 x 10 4 6 başına insan mide kanseri hücreleri (EPG85-257RDB) (numaralı seribaşı hücrelerinin sayısına göre hücre hattı hücre büyüme hızına bağlı confluency ~ tohumlama 24 saat sonra% 70-80 olmalıdır) iyi yemekler ve bu inkübe 37 ° C,% 5 CO 2, gece boyunca su buharına doymuş atmosfer.
- Kanser hücresi enfeksiyon Önceki gece tk RNAi vektör içeren E. kültürler üzerinde coli OD 600 belirlemek için bir fotometre ölçülür. 0.5 optik yoğunluk kadar bakteri çözeltinin (OD 600 = 0.5, 1.6 x 10 8 bakteri hücre / ml eşittir) ulaştı .
- FCS-co-inkübasyon bakteriyel önceki 30 dakika orta karşı karsinom hücrelerinin FCS içeren hücre kültür ortamı değiştirin.
- 1 x PBS ile iki kez bakteri yıkayın ve serum serbest Leibovitz L-15 orta sulandırmak.
- Istenen İçişleri Bakanlığı 37 kanser hücreleri (bakteri hücrelerinin kanser hücre başına enfeksiyon çokluğu = sayı) ve co-inkübe bakteri ve 2 saat boyunca kanser hücreleri için seyreltilmiş bakteri ° C
- Co-inkübasyon kanser hücrelerinin 2 saat 100 u / ml penisilin, 100 mcg / ml streptomisin, 2.5 mikrogram / ml amfoterisin, 150 mikrogram / ile desteklenmiş serum içeren Leibovitz L-15 orta bir kez 1x x PBS ile iki kez yıkanır ve sonra ml gentamisin ve 100 mg / ml kanamisin.
- 37 kanser hücrelerinin yetiştirilmesi ° C,% 5 CO 2, su buharına doymuş atmosfer devam edin.
- MRNA düzeyinde kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR ile ölçülen floresan mikroskobu, bakteriyel tedavi etkileri ve protein düzeyi western blot analizi ile görüntülenebilmekte ve FACS analiz ve hücre proliferasyon deneyleri gibi fonksiyonel testleri ile gösterilir. (Isteniyorsa, bu işlemler ayrıntılı olarak tarif edilebilir).
2) Temsilcisi Sonuçlar
Protokolü doğru yapılırsa, sonuçlar aşağıda gösterilen olanlar ile karşılaştırılabilir olmalıdır.
Floresan mikroskopi
Şekil 1 bakteriyel üç saat sonra bir insan mide kanseri hücre karşılaştırıldığında işlenmemiş bir hücre (b) (a) gösterir. Tedavi edilen hücre çekirdeğinin etrafında, bakteri tespit edilebilir.
Şekil 1: Floresan mikroskobu (1:500) sonra bakteriyel İnsan mide kanseri hücre ve işlenmemiş bir insan mide kanseri hücre kontrolü, DAPI boyama, DAPI bandpass (Λem = 640 nm), 40x objektif.
Kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR
Rakam 2 yaklaşık% 70 MDR1 mRNA down-regülasyonu (siyah ışın) tedavi bakteri ile tedavi sonrası görülebilir. Ebeveyn hücreleri MDR1 aşırı ekspresyonu eksikliği nedeniyle pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. 257RDB P170 içeren hücre hattı plazmid bir anti-MDR1 shRNAs s olarak alınan diğer R transkingdom RNAi teknolojisi doğrudan karşılaştırma ifadeNAI stratejileri susturmak. Pozitif kontrol olarak tedavi edilmezse dayanıklı hücre hattı EPG85-257RDB eksprese MDR1, plazmid ifade shRNA eksik bakteri ile tedavi aynı hücre hattı ve bu hücre hattı taşıyan bir plazmid ifade anti-MRP2 shRNAs tedavi bakteri ile tedavi alındı.
Şekil 2: terapötik E. ile tedavi sonrası kantitatif gerçek zamanlı RT PCR MDR1 mRNA anti-MDR1 shRNAs (500 İçişleri Bakanlığı 1) ifade coli ceq221. Normalizasyon housekeeping gen aldolase kullanılarak yapıldı. Tedavi edilmezse hücrelerin hücre hattı EPG85-257RDB MDR1/aldolase oranı% 100 olarak belirlenmiştir. P-değerleri öğrencinin t-testi kullanılarak hesaplandı (* = p <0.05, ** p = <0.005, *** p <0,001).
Western Blot analizi
Şekil 3 MDR1 aşağı yönetmelik bakteriyel tedavi sonrasında protein düzeyi de yer aldığını ortaya koyuyor. Bu ilaç duyarlı ebeveyn hücre hattı (EPG85-257P), tedavi edilmezse ilaca dirençli hücre hattı (EPG85 257RDB) MDR1 ifade ve tedavi örnek MDR1 ifade eksik MDR1 ifade gösterir. Bakteriyel tedavi hücrelerinin MDR1 down-regülasyonu, açık bir şekilde görülebilir. 
Şekil 3: Western blot analizi MDR1 ekspresyon düzeyleri tedavi edilmezse uyuşturucu duyarlı EPG85-257P, E. ile birlikte inkübasyondan sonra tedavi edilmezse ilaca dirençli EPG 257RDB ve EPG85-257RDB. coli ceq221 + P43 MDR1. İlköğretim Ab C219 1:100 ve anti-aktin 01:05 000, ikincil Ab anti-fare 1:10 000.
Sitotoksisite tahlil
Sitotoksisite testinde şekil 4'deki gibi Fonksiyonel analiz transkingdom RNAi işleyişi için de göstergeleridir. Ebeveyn hücre hattı ve Anıt-MDR1 shRNA plazmid ifade içeren hücre hattı daunorubisin için herhangi bir direnç görünmüyor. Dayanıklı hücre hattı EPG85-257RDB ve iki tane daha kontrol daunorubisin için yaklaşık% 90 oranında direnç tersine anti-MDR1 shRNA ifade bakteri ile tedavi örnek göre direnç önemli bir değişiklik görünmüyor.
Şekil 4: Sitotoksisite tahlil. İlaç-özel hücrenin hayatta kalabilmek için bir sitotoksisite testinde tarafından belirlenir IC50 değerleri. P-değerleri öğrencinin t-testi kullanılarak hesaplandı (* = p <0.05, ** p = <0.005, *** p <0,001).
Antrasiklin birikimi tahlil
Şekil 5 de gösterildiği gibi bakteriyel tedavi numunelerin mukavemet azaldığı (Şekil 4) göre, anti-MDR1 shRNA muamele edilen hücreler antrasiklin birikiminin yaklaşık% 90 oranında artmıştır. Ebeveyn hücre hattı ve hücre hattı 257RDB P170 güçlü bir daunorubisin birikimi% 100 gösteriyor. Dayanıklı varyant nadiren herhangi bir birikimi gösterir. Anti-MDR1 shRNA ifade bakteri ile tedavi edilen hücreler,% 90 bir anthracyline birikimi artış göstermektedir.
Şekil 5: Antrasiklin birikimi tahlil. Antrasiklin flow sitometri ile ölçülen bakteriyel 6 gün sonra karsinom hücrelerinin birikimi. P-değerleri öğrencinin t-testi kullanılarak hesaplandı (* = p <0.05, ** p = <0.005, *** p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre sayısı enfeksiyonu numaralı seribaşı ve ilgili İçişleri Bakanlığı, kritik hücre hatları ve gözlem altında büyüme hızı bağlıdır. Tohumlama için en uygun hücre sayıları bulmak için, ön deneyler büyüme hızını belirlemek için önemle tavsiye edilir. Bunun yanı sıra, farklı Mois hücreleri stres ölmeden bakteri istilası durabiliriz hangi uzatmak nedeniyle sınırlı test edilmelidir. Gözlem altında gen aşağı düzenleme değişebilir zaman en iyi noktası. En uygun koşulları bulmak için zaman belirli bir süre içinde deneyler yapılması tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
İş hibe no tarafından desteklenmiştir. "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF) 01GU0615.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
